SCAN0461

Oznaczanie aktywności trypsyny metodą Ansona

Trypsyna jest enzymem katalizującym hydrolizę wiązań peptydowych, w których grupy karbonylowe należą do argininy lub lizyny. Efektem działania trypsyny na białko są peptydy o różnej długości łańcucha. Optimum aktywności wykazuje przy pH 7-9. Cechą charakterystyczną produktów enzymatycznej hydrolizy katalizowanej przez trypsynę, wynikającą z jej specyficzności substratowej, jest występowanie w nich lizyny lub argininy jako aminokwasów C-terminalnych. W wyniku procesu trawienia trypsyna roztworu kazeiny, w środowisku zasadowym, z łańcucha polipeptydowego uwalniane są rozpuszczalne w kwasie trichlorooctowym peptydy.

Występujące w centrum aktywnym trypsyny aminokwasy seryna, histydyna i kwas asparaginowy zwane są triadą katalityczną; triada ta występuje jest miejscem aktywnym wielu a/(3 fałdowych hydrolaz i zawiera trzy katalityczne reszty, występujące zawsze w tej kolejności w sekwencji aminokwasowej:

1.    Reszta nukleofilową (seryna, cysteina lub asparaginian),

2.    Reszta katalityczną kwasu (asparaginowego lub glutaminowego),

3.    Reszta histydyny.

Za pomocą odczynnika Folina-Ciocalteu można oznaczyć zawartość tyrozyny w uwolnionych peptydach. Oznaczenia dokonuje się fotometrycznie, wykorzystując natężenie barwy badanej próby wprost proporcjonalnie do ilości zawartej w niej tyrozyny. W środowisku zasadowym odczynnik fosforomolibdenofosforowolframowy jest redukowany zawartą w peptydach tyrozyną do błękitu fosforomolibdenowego. W ćwiczeniu podjęta zostanie również próba określenia aktywności katalitycznej triady aminokwasów obecnych w miejscu aktywnym trypsyny w postaci wolnej.

4