PŻ1

INHIBITORY TRYPSYNY

Oznaczenie aktywności inhibitorów tiypsyny metodą Kakade i in. z zastosowaniem substratu syntetycznego BAPNA (N-a-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide-hydrochloride).

Sporządzić ekstrakt:

1 g produktu zalać 50 cm 0,0 IN NaOH i wytrząsać przez 1 godz. Następnie wyciąg odwirować przez 20 min. przy 3500 obr./min. Zlać płyn znad osadu do kolbki (jeśli trzeba przesączyć).

Następnie sporządzić rozcieńczenie roztworu tak, aby 1 ml zawiesiny po ekstrakcji hamował aktywność trypsyny w zakresie 40-60%. W tym celu należy sporządzić kilka rozcieńczeń z otrzymanego ekstraktu rozpoczynając od (soja: 1:50, groch 1:4; bób 1:3).

Do dwóch probówek pobieramy po 1 cm rozcieńczonego ekstraktu, dodajemy 1 cm wody, 2 cm trypsyny. Równocześnie sporządzamy roztwór standardowy trypsyny, czyli do probówki pobieramy 2 cm tiypsyny i 2 cm wody. Wszystkie probówki umieszczamy w termostacie na 37°C przez 1 Omiń. Po wyrównaniu się temperatur w probówkach do każdej z nich dodajemy w odstępach 30 s. 5 ml roztworu' BAPNA, dokładnie mieszamy i inkubujemy próbki. Dokładnie po upływie 10 min przerywamy reakcję dodając 1 ml 30% kwasu octowego. Po ochłodzeniu odczytujemy ekstynkcję trypsyny i próbek przy długości fali 410 nm wobec ślepej próby.    $

• Ślepą próbę przygotowujemy poprzez dodanie 1 ml 30% kwasu octowego do probówki zawierającej 2 ml roztworu trypsyny i 2 ml wody, a następnie dodajemy 5 ml roztworu BAPNA.

Przykładowe obliczenie hamowania aktywności trvpsvnv:

E trypsyny 0,350 i 35 TIU 1 próbki 0,18 =18 TIU

35 TIU- 100%

18 TIU- x

x= 51,42%

hamowanie 100 - x

• Jeśli hamowanie trypsyny mieści się w zakresie 40-60% to przechodzimy do dalszych etapów oznaczenia, jeśli zaś hamowanie jest większe od 60% należy próbkę ponownie rozcieńczyć i powtórzyć analizę. Jeśli hamowanie jest mniejsze od 40% należy zmniejszyć rozcieńczenie próbki i powtórzyć analizę.

Po ustaleniu rozcieńczenia przystępujemy do analizy właściwej. W tym celu do 3 probówek pobieramy 0,8 1,0 1,2 ml ekstraktu po rozcieńczeniu i dopełniamy do 2 ml wodą. Do każdej probówki dodajemy 2 ml roztworu trypsyny i umieszczamy w termostacie na 37°C. Po wyrównaniu temperatur (ok. 10 min) do każdej probówki w odstępach 30 s dodajemy 5 ml roztworu BAPNA, a po 10 minutach przerywamy reakcję przez dodanie 1 ml 30% kwasu octowego. Po dokładnym wymieszaniu zawartość próbek należy (jeśli jest to konieczne) przesączyć i zmierzyć absorbcję przy długości fali 410 nm wobec ślepej próby wykonanej j.w. Oznaczenie należy wykonać co najmniej w dwóch powtórzeniach.