274845135

A.    Przygotowanie liofilizatu dehydrogenazy alkoholowej

Odpowiednią ilość dehydrogenazy alkoholowej rozpuścić w buforze fosforanowym tak, aby jej stężenie wynosiło 0,1 mg białka na ml. Odmierzyć po 100 pl roztworu enzymu do dobrej jakości probówek Eppendorfa. Zliofilizować. Liofilizat zamrozić w -80°C. Próbę z tak przygotowanym enzymem oznaczyć jako 0.

B.    Wpływ rozpuszczalników organicznych na termostabilność dehydrogenazy alkoholowej

Do trzech probówek zawierających zliofilizowany enzym (próby nr 1,2, 3) odpipetować po 100 pl buforu fosforanowego, do trzech kolejnych (próby nr 4, 5, 6) polOO pl toluenu a do 3 następnych (próby nr 7, 8, 9) po 100 pl dodecanu. Zawiesić starannie enzym w rozpuszczalniku i następnie inkubować przez dwie godziny: próby 1, 4, 7 w temperaturze 25°C, próby 2, 5, 8 w 50°C a próby 3, 6, 9 w temperaturze 75°C. Po zakończonej inkubacji wszystkie próby zliofilizować i przechowywać w temperaturze -80°C.

C.    Oznaczanie aktywności dehydrogenazy alkoholowej

Oznaczenie polega na pomiarze w czasie zmian wartości absorbancji przy długości fali 340 nm, spowodowanych redukcją NAD w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę alkoholową. Pomiary przeprowadzić dla wszystkich prób zawierających enzym poddany inkubacji (etap B - próby 1-9) oraz dla jednej porcji wyjściowego preparatu enzymu (etap A - próba 0).

Bezpośrednio przed pomiarem rozpuścić otrzymane liofilizaty enzymu w 100 pl buforu fosforanowego. Po dokładnym wymieszaniu roztwory enzymu należy dalej rozcieńczyć wg wskazań asystenta, tak aby obserwowane zmiany absorbancji na minutę zawierały się w granicach od 0,012 do 0,100. Próby z enzymem po rozcieńczeniu starannie wymieszać.

Do kuwety o pojemności 2 ml i przekroju 1 cm odmierzyć 1,42 ml buforu fosforanowego, 35 pl roztworu NAD , oraz 30 pl rozcieńczonego enzymu. Zawartość kuwety dokładnie wymieszać i zmierzyć absorbcję wobec próby odniesienia zawierającej wodę destylowaną. Obserwować zmiany absorbcji przez ok. 1 min, a następnie rozpocząć reakcję dodaniem 15 ml roztworu etanolu. Zawartość kuwety starannie wymieszać. W momencie dodania etanolu uruchomić pomiar czasu i odczytywać zmiany absorbancji co 15 sekund przez ok. 3 min.

D.    Opracowanie wyników

Zanotowane dane pomiarowe należy przeliczyć, posługując się arkuszem sprawozdania.

Zmiany wartości absorbancji przy 340 nm w czasie należy odłożyć na wykresach i wyliczyć szybkość początkową reakcji Vo = A absorbancji min^-1. Otrzymane wyniki przeliczyć na aktywność całkowitą w kuwecie w pmolach min^-1 wiedząc, że milimolowy współczynnik absorbancji dla NADH przy długości fali 340 nm wynosi e = 6,22 mM"¹ cm"¹.

Znając całkowitą zawartość białka w kuwecie pomiarowej, obliczyć aktywność właściwą dehydrogenazy alkoholowej (pmol min"¹ mg"¹ białka) w próbach inkubowanych w różnych rozpuszczalnikach i w różnych temperaturach. Wyliczyć % aktywności w stosunku do wyjściowej próby dehydrogenazy alkoholowej. Wyniki zestawić w tabeli.

Na podstawie uzyskanych wyników wyciągnąć wnioski na temat wpływu rozpuszczalnika na stabilność dehydrogenazy alkoholowej.