Celem ćwiczenia jest fluorymetryczne oznaczanie stężenia glukozy. Glukozę można oznaczyć na podstawie przyrostu ilości NADPH (maksimum absorbancji 340 nm, maksimum emisji przy 465 nm) w reakcjach katalizowanych przez heksokinazę (1)
Glukoza + ATP *-* Glukozo-6-fosforan + ADP (1) a następnie dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową (2)
Glukozo-6-fosforan + NADP <-► 6-fosfoglukonian + NADPH + H* (2)
Materiały i odczynniki
1. 0,1 M buforu Tris-HCl o pH = 8,1
2. 0,1 M roztwór MgCl2
3. 10 mM roztwór ATP
4. roztwór NADP o stężeniu 10 mg ml"1
5. roztwór wzorca glukozy
6. roztwór heksokinazy
7. roztwór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej Materiały pomocnicze i aparatura
Spektrofluorymetr, pipety automatyczne, kuwety, szpatułki, mikromieszadło
A. Oznaczanie zawartości glukozy w próbie badanej
Do kuwety fluorymetrycznej odmierzyć:
- 100 pl 10 mM ATP
- 200 pl 0,1 M MgCl2
- 40 pl NADP o stężeniu 10 mg/ml
- 1630 pl 0,1 M buforu Tris-HCl o pH = 8,1
- 10 pl próby badanej
- 10 pl dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej
Rozpocząć pomiar. Po ustabilizowaniu się odczytu dodać 10 pl heksokinazy i obserwować przebieg reakcji. Po jej zakończniu dodać 10 pl roztworu wzorca glukozy i znów obserwować przebieg reacji. Po zakończeniu reakcji odczytać zmiany fluorescencji osobno dla wzorca i osobno dla próby badanej. Wiedząc o ile jednostek zmieniła się fluorescencja w kuwecie po dodaniu wzorca, obliczyć ile glukozy zawierała próba badana. Następnie wykorzystując milimolowy współczynnik absorbacji dla NADPH (e = 6,22 mM"1 cm"1 przy długości fali 340 nm) wyliczyć zmianę absorbacji jaką można by było zaobserwować śledząc oznaczenie takiej samej próby badanej, w tych samych warunkach, przy użyciu spektrofotometru absorbcyjnego.
Zanotowane dane pomiarowe należy przeliczyć, posługując się arkuszem sprawozdania.