274845137

Celem ćwiczenia jest fluorymetryczne oznaczanie stężenia glukozy. Glukozę można oznaczyć na podstawie przyrostu ilości NADPH (maksimum absorbancji 340 nm, maksimum emisji przy 465 nm) w reakcjach katalizowanych przez heksokinazę (1)

Glukoza + ATP *-* Glukozo-6-fosforan + ADP (1) a następnie dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową (2)

Glukozo-6-fosforan + NADP <-► 6-fosfoglukonian + NADPH + H* (2)

Wykonanie

Materiały i odczynniki

1.    0,1 M buforu Tris-HCl o pH = 8,1

2.    0,1 M roztwór MgCl₂

3.    10 mM roztwór ATP

4.    roztwór NADP o stężeniu 10 mg ml"¹

5.    roztwór wzorca glukozy

6.    roztwór heksokinazy

7.    roztwór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej Materiały pomocnicze i aparatura

Spektrofluorymetr, pipety automatyczne, kuwety, szpatułki, mikromieszadło

A. Oznaczanie zawartości glukozy w próbie badanej

Do kuwety fluorymetrycznej odmierzyć:

-    100 pl 10 mM ATP

-    200 pl 0,1 M MgCl₂

-    40 pl NADP o stężeniu 10 mg/ml

-    1630 pl 0,1 M buforu Tris-HCl o pH = 8,1

-    10 pl próby badanej

-    10 pl dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej

Rozpocząć pomiar. Po ustabilizowaniu się odczytu dodać 10 pl heksokinazy i obserwować przebieg reakcji. Po jej zakończniu dodać 10 pl roztworu wzorca glukozy i znów obserwować przebieg reacji. Po zakończeniu reakcji odczytać zmiany fluorescencji osobno dla wzorca i osobno dla próby badanej. Wiedząc o ile jednostek zmieniła się fluorescencja w kuwecie po dodaniu wzorca, obliczyć ile glukozy zawierała próba badana. Następnie wykorzystując milimolowy współczynnik absorbacji dla NADPH (e = 6,22 mM"¹ cm"¹ przy długości fali 340 nm) wyliczyć zmianę absorbacji jaką można by było zaobserwować śledząc oznaczenie takiej samej próby badanej, w tych samych warunkach, przy użyciu spektrofotometru absorbcyjnego.

Zanotowane dane pomiarowe należy przeliczyć, posługując się arkuszem sprawozdania.