2906542633

Chemiczna Synteza Genu Insuliny Ludzkiej i jego Ekspresja w komórkach Escherichia coli

W październiku 1977 r. zespół chemików: K. Itakura, R. Crea, T. Hirose i A Kraszewski*) z City of Hope Medical Center w Duarte koło Los Angelos oraz zespół biochemików: D. Goeddel, D. Kleid, F. Bolivar, H. Heyneker, D. Yansura z firmy Genentech z San Francisco i A. Riggs z City of Hope Medical Center podjęły prace nad otrzymaniem insuliny ludzkiej przy pomocy technik inżynierii genetycznej.

W pierwszym etapie dokonano syntezy genów łańcucha „A” i „B” insuliny. Synteza polegała na przygotowaniu od 0,5 do 1,0 mola odpowiednio zablokowanych monomerów pochodnych 3'-fosforanów tymidyny, dezoksycytydyny, dezoksyadeno-zyny i dezoksyguanozyny z ich preparatów handlowych nukleozydów. Monomery posłużyły do syntezy 45 trójnukleotydów, które w większości stanowiły kodony aminokwasów łańcucha insuliny. W ten sposób utworzona została „biblioteka” „trójek” kodonowych stanowiących bloki służące do łączenia w dłuższe oligomery. Według tej koncepcji dokonano syntezy 29 oligomerów o długości od 10 do 15 jednostek nukleo-tydowych. Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa, elektroforeza w żelu poli-akryloamidowym oraz analiza sekwencyjna pozwoliły stwierdzić nie mniejszą niż 95°/o czystość preparatów oraz ich poprawny skład nukleotydowy. Syntetyczne odcinki DNA połączono za pomocą ligazy DNA z faga T-4 w łańcuch DNA o sekwencji zawierającej gen strukturalny insuliny poprzedzony kodonem metioniny oraz zakończony sygnałami terminującymi proces translacji. Skrajne sekwencje stanowiły tak zwane lepkie końce umożliwiające połączenie syntetycznego genu z plazmidem. W ten sposób zakończono pierwszy etap to jest chemiczno-enzymatyczną syntezę genów łańcuchów „A” i „B” insuliny ludzkiej.

W drugim etapie syntetyczne geny zostały połączone z plazmidem przy pomocy ligazy DNA. Do tego celu użyto plazmidu pBR 322 zawierającego dużą część genu fj-galaktozydazy (3009 par zasad kodujących 1003 aminokwasów), który po rekombinacji poprzedzał gen syntetyczny. W ten sposób region kontroli biosyntezy -galak-tozydazy kontrolował jednocześnie inicjację transkrypcji i translacji genu syntetycznego. Taki hybrydowy DNA został wprowadzony, (transformowany) do komórek E.coli. W trakcie namnażania bakterii uzyskano także powielenie plazmidu z genem insuliny. Po izolacji plazmidu „wycięto” przy pomocy odpowiednich enzymów restrykcyjnych gen syntetyczny i sprawdzono sekwencję jego nukleotydów — okazała się one poprawną. Powtórzono więc cykl: włączenie genu insuliny do plazmidu transformacja bakteriiich wzrost. Po uzyskaniu wystarczającej liczby komórek wyizolowano z nich hybrydy peptydowe: (3-galaktozydaza—łańcuch „B” insuliny ludzkiej i P-galaktozydaza—łańcuch „A” insuliny ludzkiej. Stosując następnie bro-mocyjan, który selektywnie rozszczepia łańcuch peptydowy za resztą metioniny oddzielono łańcuchy „A” i „B” od pozostałej części peptydu.

Dla wykazania ekspresji syntetycznych genów wykonano następujące testy i analizy stwierdzające obecność łańcuchów „A” i „B” insuliny ludzkiej:

a) testy radioimmunologiczne następujących rekombinantów:

• Staż podoktorski, adiunkt Zakładu Stereochemil Produktów Naturalnych Instytutu Chemii Organicznej PAN w Poznaniu.

10 Postępy Biochemii