3725451935

*    testy rozetkowe - mają już dzisiaj znaczenie historyczne. Różnicowały limfocyty T, które charakteryzują się zdolnością tworzenia rozetek z erytrocytami barana - test E (wiązanie poprzez CD2) oraz limfocyty B -test EA (erytrocyty opłaszczone przeciwciałem wiązały się poprzez receptor Fc na limfocycie B) oraz test EAC (erytrocyty opłaszczone przeciwciałem i dopełniaczem wiązały się poprzez receptor C3). U dorosłej osoby wartości testu E: 60 - 75%, testów EA i EAC: 20 - 25%.

Studenci oglądają test E przygotowany wcześniej w mikroskopie oraz na zdjęciach.

*    metody immunofluorescencyine - pozwalają określić antygeny powierzchniowe (molekuły o różnym ciężarze cząsteczkowym) żywych komórek ocenia się metodą IF bezpośredniej wykorzystując swoiste przeciwciała monoklonalne mysie lub IF pośredniej (dodatkowo dodaje się surowicę antyglobulinową mysią), np.

-    anty-CD3 - wykrywa limfocyty T CD3(+), tj. receptor odpowiedzialny za przekazywanie sygnału antygenowego do limfocytów T,

-    anty-CD4 - wykrywa limfocyty Th CD4(+) - receptor dla MHC kl.II i HIV

-    anty-CD8 - wykrywa limfocyty Tc/Ts CD8(+) - oraz niektórych NK

-    anty-CD19 - wykrywa limfocyty B i pre-B, receptor odpowiedzialny za aktywację i proliferację B Normy w krwi obwodowej:

T CD3 70 - 75%

T CD4 50 - 55%

T CD8 20 - 25%

BCD19 20-25%

Wskaźnik CD4/CD8 1,7-2,0

Studenci oglądają prospekty z przeciwciałami monoklonalnymi mysimi oraz wykrywanie subpopulacji limfocytów metodą IF pośredniej. Świecenie, w zależności od stosunków biochemicznych w komórce może być regularne pierścieniowe (równomierne rozmieszczenie antygenu, duże stężenie przeciwciał), kropkowe (duże rozcieńczenie przeciwciał, najczęściej występuje) lub obraz czapeczki (capping antygeny zgrupowane na biegunie komórki).

Ocena funkcji limfocytów

Rozwój odpowiedzi immunologicznej związany jest z proliferacją określonej subpopulacji limfocytów, które normalnie znajdują się w stanie spoczynku. Dochodzi do przeniesienia sygnału prze błonę cytoplazmatyczną i aktywacji wewnątrzkomórkowych przemian enzymatycznych. Morfologicznie małe limfocyty przekształcają się w duże komórki blastyczne (duże jądro o luźnej chromatynie, widoczne jąderka, podziały mitotyczne, chromosomy, rzadsza cytoplazma..). Pobudzone limfocyty syntetyzują i uwalniają do środowiska różne cytokiny.

*test transformacji blastycznei - ocenia zdolność limfocytów do proliferacji. Limfocyty stymuluje się swoistymi antygenami, np. oczyszczona tuberkulina - PPD, anatoksyna tężcowa, drożdżaki, gronkowce... (w przypadku pierwotnej stymulacji transformuje kilka % limfocytów, przy wtórnej - ok. 15%) lub tzw. nieswoistymi mitogenami, które mogą być pochodzenia roślinnego (lektyny) lub bakteryjnego, np. fitohemaglutynina (PHA - stymuluje limfocyty T i B), konkanawalina A (ConA - limfocyty T), mitogen szkarłatki -PWM (limfocyt B), lipopolisacharyd (LPS - limfocyty B), białko A gronkowca (limfocyty B). Pod wpływem mitogenów transformuje 70 - 90% komórek. Stosuje się:

*    metoda morfologiczna - odsetek komórek blastycznych ocenia się w mikroskopie świetlnym, w preparacie wykonanym z osadu 3-5 dniowej hodowli izolowanych limfocytów z mitogenem lub antygenem.

Studenci oglądają preparaty z tranformacji blastycznej limfocytów pod wpływem PHA barwione metodą May-Grunwalda-G/e/WAy, zwracając uwagę na odsetek i wygląd transformowanych komórek.

*    metoda izotopowa - proliferację ocenia się przez pomiar włączania tymidyny znakowanej trytem do DNA jąder dzielących się intensywnie komórek blastycznych po stymulacji mitogenem czy antygenem. Określa się indeks stymulacyjny w stosunku do kontroli (hodowla limfocytów bez stymulacji).

*    test mieszanej hodowli limfocytów - limfocyty pochodzące od różnych genetycznie dawców, hodowane razem, ulegają proliferacji ze względu na różnice w składzie antygenów zgodności tkankowej. Im większa zgodność, tym mniejsza proliferacja, (przy przeszczepie szpiku).

*    test hamowania miarach leukocytów - MIF - ocenia on zdolność limfocytów do produkcji pod wpływem mitogenu lub antygenu cytokin (głównie IFN-y), które hamują migrację komórek fagocytujących (makrofagi, granulocyty). Określa się wskaźnik zahamowania migracji w stosunku do kontroli.

Studenci oglądają test zahamowania migracji pod wpływem PHA (u dorosłych wskaźnik 0,2 - 0,4). Pod wpływem antygenów jest zawsze wyższy, np.0,5 -0,7.

Proliferacja oraz zahamowanie migracji może być upośledzone w niedoborach pierwotnych i wtórnych, oparzeniach, chorobach autoimmunizacyjnych, immunosupresji, zakażeniach HIV. Laboratoria powinny mieć swoje normy.