5192605664

40 A. KOZIK [8]

techniki Hummela i Dryera (51). Wszystkie te metody nie zyskały jednak popularności z uwagi na konieczność użycia skomplikowanego układu eksperymentalnego.

Trudności te usunięto w opracowanej ostatnio technice cyklicznego podziału żelowego (54), w której roztwór zawierający białko i ligand przepływa w sposób ciągły przez zawiesinę żelu. Rejestruje się absor-bancję krążącego roztworu.

Najpierw kalibruje się układ, wyznaczając stężeniową zależność współczynnika podziału ligandu między fazę stacjonarną i ruchomą. Tym samym określa się zarazem stopień wiązania ligandu przez żel. Po wprowadzeniu do obwodu określonej ilości białka i ligandu i po ustaleniu się równowagi, oznacza się stężenie ligandu w krążącym roztworze. Uwzględniając wartość współczynnika podziału, odczytaną z krzywej kalibracyjnej, można obliczyć ilość ligandu w fazie stacjonarnej, a następnie r i [L].

Zaletą techniki jest szybkie ustalanie się równowagi podziału, a także możliwość znacznej miniaturyzacji i zminimalizowania zużycia białka. Zachowana została wysoka precyzja oznaczeń, ale również wada, w postaci ograniczenia do układów izozbestycznych.

IV. Ilościowa chromatografia powinowactwa

Tzw. chromatografia powinowactwa opiera się na wykorzystaniu podłóż chromatograficznych, zawierających różne ligandy unieruchomione kowalencyjnie. Ten rodzaj chromatografii adsorpcyjnej pozwala na szybkie i efektywne izolowanie białek specyficznych względem wybranego ligandu. Ogólne zasady metody oraz zakresy zastosowań omawiane są w licznych artykułach przeglądowych (55, 56), a także obszerniejszych opracowaniach (57—62). Kierunek, polegający na wykorzystaniu tej techniki do wyznaczania parametrów oddziaływań białek z innymi substancjami, określa się mianem „ilościowej chromatografii powinowactwa” (63).

Jej rozwój datuje się od momentu, gdy Andrews i wsp. (64), zaobserwowawszy wpływ rozpuszczalnych monosacharydów na zwiększoną adsorpcję galaktozylotransferazy wymywanej strefowo z a-lakto-albuminy sprzężonej z Sepharose, wyprowadzili równania opisujące ilościowo oddziaływania między wymienionymi składnikami. W podobny sposób zbadano kilka analogicznych układów, w których ligand rozpuszczalny indukuje wiązanie białka przez ligand unieruchomiony (65—68). Przykładowy sposób analizy (68) opiera się na następującym schemacie równowag: