przykładowo na obserwowanie zmian w centrum katalitycznym enzymu. Często wykorzystuje się w tym zakresie technikę znakowania białek ciężkimi izotopami (l5N) lub mutagenezę ukierunkowaną. Pozwala to na precyzyjne przypisanie określonych pasm widocznych w widmie białka konkretnym resztom aminokwasowym.
5.3.1. Określanie struktury drugorzędowej białek
Białka posiadają dziewięć charakterystycznych pasm, z których największe znaczenie w analizie struktury drugorzędowej mają przedstawione na Rys.4: pasmo amidowe I (odpowiadające głównie drganiom rozciągającym wiązania C=0, ok. 1700-1600 cm'1), pasmo amidowe II (odpowiadające sprzężonym drganiom zginającym wiązania N-H i rozciągającym wiązania C-N, ok. 1600-1500 cm'1) oraz w mniejszym stopniu pasmo amidowe III (odpowiadające głównie drganiom rozciągającym wiązania C-N i drganiom zginającym wiązania N-H, ok. 1340 - 1200 cm’1).
Rys. 4. Charakterystyczne widmo czystego białka (lizozym z białka jaja kurzego) rozpuszczonego w wodzie wraz z zaznaczonymi najważniejszymi pasmami amidowymi, służącymi do analizy zmian w jego strukturze. Widmo jest wynikiem odjęcia zmierzonego widma ATR czystej wody od widma ATR roztworu białka. Wskaźnikiem prawidłowego odjęcia widm było uzyskanie płaskiego przebiegu linii bazowej widma wynikowego powyżej 1800 cm'1.
Ograniczenia steryczne, hydrofobowy/hydrofilowy charakter reszt bocznych aminokwasów jak i samego szkieletu polipeptydowego, a także otaczający białko rozpuszczalnik powodują, że białka przyjmują w roztworach wodnych ściśle określone konformacje geometryczne, zwane strukturami drugorzędowymi. Istotnym elementem każdej z nich jest charakterystyczna sieć wiązań wodorowych między atomami tlenu karbonylowego łańcucha polipeptydowego a atomem wodoru grupy aminowej, które spinają fragmenty łańcucha polipeptydowego, często znacznie oddalone od siebie. Każda ze struktur drugorzędowych białek posiada charakterystyczną geometrię sieci wiązań wodorowych, a co za tym idzie, także charakterystyczne zakresy częstości drgań wiązań zaangażowanych w ich tworzenie. Na Rys. 5 przedstawiono zakresy częstości drgań wiązań w zakresie pasma amidowego I, najczęściej wykorzystywanego do określania zawartości poszczególnych struktur drugorzędowych, przypisane poszczególnym strukturom drugorzędowym. Wartości te opierają się głównie na danych eksperymentalnych oraz obliczeniach teoretycznych.