8851686589

15

I. Izolacja materiału genetycznegojako punkt nyjścia w procedurach molekularnych

BRyc. 1. Przykładów)' rozdział w żelu agarozowym plazmidowego DNA. Na ścieżkach 1-3 przedstawiono rozdział izolatu plazmidowego DNA, na ścieżce 4 uwidoczniony rozdział wzorca wielkości DNA. Strzałką przedstawiono kierunek rozdziału elektroforetycznego. Najszybciej wędrującą frakcją jest frakcja CCC plazmidu, następnie r I frakcja liniowa, natomiast najwolniej wędruje frakcja OC \ /    plazmidu.

12    3    4

3. Izolacja genomowego DNA

Izolacja genomowego DNA nastręcza sporo trudności, których źródło tkwi głównie w wielkości cząsteczek DNA. Duże cząsteczki DNA genomowego są wprawdzie dość trwale chemicznie, jednak ulegają łatwo mechanicznej degradacji przez zbyt intensywnie prowadzoną dezintegrację komórek lub zwykle pipetowanie lizatów. Najczęściej stosowane metody izolacji genomowego DNA opierają się bądź na wysalaniu białek stężonymi roztworami soli, bądź też na ekstrakcji fenolowo-chloroformowej. Odczyn fenolu musi być zasadowy, gdyż w kwaśnym pH DNA ulega ekstrakcji do fazy organicznej lub pozostaje w między fazie wraz ze zdenaturowanymi białkami, zamiast pozostawać w fazie wodnej. Otrzymywane po odbialczaniu izolaty kwasu dezoksyrybonukleinowego (pozostające w nadsączu) są oczyszczane, analogicznie do wcześniej opisanej strategii postępowania, przez precypitację roztworami etanolu lub izopropanolu, albo są oczyszczane na kolumienkach chromatograficznych wypełnionych złożami krzemionkowymi. Trawienie błon komórkowych i liżę komórek przeprowadza się zwykle za pomocą proteinazy K w obecności EDTA jako głównego czynnika hamującego aktywność DNaz oraz w obecności detergentów, np. SDS.

Znana jest metoda izolacji wysokocząsteczkowego DNA za pomocą formamidu; umożliwia ona otrzymanie bardzo dużych, niezdegradowanych cząsteczek DNA (ponad 200 kpz), w związku z czym stosuje się ją zwłaszcza w procedurach wykorzystywanych w konstrukcji bibliotek genomowych. Metoda izolacji z formamidem jest niestety bardzo czasochłonna i mało wydajna. Otrzymany lizat komórkowy jest traktowany stężonym roztworem formamidu, który pełni rolę czynnika denaturującego białka i ułatwiającego oddzielenie histonów od DNA. Oczyszczanie wyizolowanego tą techniką DNA przeprowadzane jest na drodze dializy.

Dobór metody izolacji genomowego DNA w dużym stopniu wiąże się z dalszym przeznaczeniem ekstraktu kwasu nukleinowego. Rozwój technik molekularnych, otrzymywanie zmodyfikowanych na drodze rekombinacji genetycznej enzymów o coraz wyższym stopniu trwałości, odporności na czynniki środowiska reakcyjnego, pozwala posługiwać się również prostymi metodami izolacji materiału genetycznego, często pobieranego do danej reakcji wprost z lizatu komórkowego. Do celów amplifikacji fragmentów DNA