8851686585

11

I. Izolacja materiału genetycznegojako punkt wyjścia w procedurach molekularnych

rzystuje się ją do oczyszczania nie tylko natywnych wyizolowanych cząsteczek DNA, lecz także syntetycznych cząsteczek, np. amplimerów — produktów PCR służących między innymi do klonowania czy wykorzystywanych w kolejnych procedurach badawczych, np. w sekwencjonowaniu. Kolumny chromatograficzne stosowane do oczyszczania DNA zwykle wypełnione są żelem krzemionkowym. Stopniowe eluowanie z kolumny substancji balastowych, a na końcu eluowanie właściwego DNA daje ostatecznie czysty ekstrakt kwasu nukleinowego.

Po wytrąceniu alkoholem DNA jest wirowany, następnie suszony (najczęściej w temperaturze pokojowej) i w takiej postaci (lub ewentualnie po rozpuszczeniu w wodzie lub buforze TE — Tris-EDTA) jest przechowywany. Ekstrakty DNA można przechowywać temp. 4°C, niemniej jednak, w celu wydłużenia ich trwałości, zaleca się przechowywanie w temp. -20°C lub nawet -80°C.

2. Izolacja plazmidowego DNA

Wielkość plazmidowego DNA jest zróżnicowana — zwykle wynosi od 1000 do kilku tysięcy par zasad, jednak duże plazmidy mogą mieć wielkość nawet do 20 kpz. Ogólnie można przyjąć, że rozmiary plazmidów są znacznie niższe w porównaniu z rozmiarami genomowego DNA bakterii, czy też genomowego DNA komórek eukariotycznych. Typowe plazmidy są zbudowane z dwuniciowych cząsteczek DNA (dsDNA) przyjmujących trzy różne podstawowe konformacje: w formie kolistej zrelaksowanej, kolistej superheli-kalnej (superskręconej — CCC — co/alentty closed circleś) oraz formie liniowej. Na wydajność izolacji plazmidowego DNA wpływa między innymi kopijność plazmidów wynikająca z różnego tempa replikacji w komórkach bakterii. W celu relatywnego zwiększenia liczby plazmidów w hodowli można zastosować antybiotyk selektywnie hamujący replikację bakteryjnego genoforu, natomiast preferującego w ten sposób replikację plazmidów w komórce bakteryjnej. Tak działającym antybiotykiem jest m.in. chloramfenikol, który blokując syntezę DNA genomowego nie wpływa na replikację plazmidów.

Uzyskanie plazmidowego DNA obejmuje kilka istotnych etapów, z których część dotyczy uzyskania komórek bakteryjnych będących źródłem plazmidu. Etapy te, to:

•    transformacja bakterii wybranym plazmidem,

•    selekcja transformantów na podłożach selekcyjnych,

•    namnożenie czystej transformowanej plazmidem hodowli bakteryjnej,

•    liza namnożonych komórek bakteryjnych,

•    izolacja i oczyszczanie plazmidów.

Namnażanie hodowli bakteryjnej prowadzi się zazwyczaj do momentu osiągnięcia późnej fazy logarytmicznego wzrostu hodowli bakteryjnej (można ją określić na podstawie pomiaru gęstości optycznej OD Optical Density, przy długości fali A. = 600 nm; w zależności od używanej aparatury odczyt absorbancji może mieć miejsce przy długości fali 550 nm, wyznaczenie widma absorpcji ułatwi dobór właściwej długości fali do pomiarów); najczęściej hodowle prowadzi się w systemie hodowli całonocnych, trwających około 16 godzin. W fazie wzrostu logarytmicznego dochodzi do osiągnięcia maksymalnej liczby komórek w hodowli przy jednoczesnej intensywnej replikacji plazmidów, a niskiej już skali replikacji DNA chromosomalnego i niskiej biosyntezie RNA. W zależności od skali izolacji plazmidowego DNA wyróżnia się następujące rodzaje izolacji: