8851686587

I. Izolacja materiału genetycznego jako punkt wyjścia w procedurach molekularnych 13

macji w preparatyce plazmidów. Różnice w gęstości liniowych form DNA i DNA plazmidowego CCC nasilają się w środowisku alkalicznym oraz po dodaniu do roztworu zawierającego plazmidowy DNA związku interkalującego w strukturę dsDNA — bromku etydy-ny. Interkalacja powoduje częściowe rozluźnienie i rozwinięcie helisy dsDNA, a to powoduje obniżenie gęstości całej cząsteczki. W przypadku formy superzwiniętej intrerkalacja bromku etydyny jest utrudniona i nie wpływa znacząco na gęstość plazmidowego DNA. W gradiencie alkalicznej sacharozy (5—20%) następuje dodatkowo denaturacja dsDNA w formie liniowej lub kolistej, zrelaksowanej, natomiast forma CCC plazmidowego DNA mimo denaturacji pozostaje w postaci superzwiniętej. Ostatecznie powoduje to 3—4-krot-ne przyspieszenie sedymentacji plazmidów CCC w porównaniu z liniowym i zrelaksowanym DNA. Zjawisko to wykorzystywane jest w metodzie izolacji plazmidów za pomocą ultrawirowania w gradiencie chlorku cezu lub alkalicznej sacharozy.

Metody izolacji plazmidowego DNA wykorzystujące jego konformację to także metoda lizy alkalicznej oraz metoda lizy termicznej (ang. boiling lysiś). Liza alkaliczna w połączeniu z retergentami (najczęściej SDS) jest najpopularniejszą metodą izolacji plazmidowego DNA. W warunkach wysokiego pH (około 12) lub krótkotrwałego gotowania liza-tów dochodzi do denaturacji nici dsDNA. Po neutralizacji środowiska lub obniżeniu temperatury zachodzi renaturacja łańcuchów, jednak w przypadku długich nici genomowego DNA w warunkach stwarzanych w tych metodach zachodzi przypadkowe łączenie się fragmentów DNA, co przy dodatkowym zastosowaniu wysokich stężeń soli, powoduje precypitację genomowego DNA wraz ze denaturowanymi białkami i większością RNA. Obecność SDS dodatkowo odpowiada za denaturację białek bakteryjnych. Ponadto, w środowisku alkalicznym, długie, jednoniciowe cząsteczki DNA, a zwłaszcza cząsteczki RNA, są podatne na przypadkowe pęknięcia prowadzące do częściowej ich degradacji. Plazmidowy DNA w warunkach lizy alkalicznej lub gotowania również ulega denaturacji, jednak łańcuchy DNA nie podlegają fizycznemu rozdziałowi ze względu na ich konformację umożliwiającą utrzymywanie stałego kontaktu. Neutralizacja środowiska zezwala wówczas pozostającym w bliskim sąsiedztwie łańcuchom plazmidowego DNA odtworzyć pierwotną dwuniciową strukturę.

Metoda wykorzystująca liżę termiczną jest zalecana do izolacji na małą skalę niewielkich plazmidów (poniżej 15 kpz). Często jest łączona z procedurą oczyszczania przez różnicowe wytrącanie glikolami polietylenowymi.

Wśród metod izolacji plazmidowego DNA istnieją także takie, które są oparte są na zasadzie różnicowej precypitacji DNA plazmidowego i DNA genomowego. Najczęściej stosowane są protokoły wykorzystujące selektywną precypitację genomowego DNA z li-zatu komórkowego glikolami polietylenowymi (głównie PEG-8000). Stosowaną zwykle odmianą tej metody jest modyfikacja oryginalnego protokołu (R. Treisman) przez Nico-letti i Condorelli. W pierwszym etapie lizat komórkowy (zwykle po lizie alkalicznej) jest traktowany chlorkiem litu lub RNazą w celu usunięcia RNA. Następnie na lizat działa się roztworem zawierającym PEG-8000 i chlorek magnezu w celu selektywnej precypitacji plazmidowego DNA. Można także zastosować dodatkowe oczyszczanie za pomocą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej i przemywania etanolem. Ograniczeniem metod opartych na selektywnej precypitacji DNA jest wielkość izolowanych plazmidów — nie nadają się one do wykorzystania w przypadku izolacji bardzo dużych plazmidów (rzędu 15-20 kpz). W celu izolacji bakteryjnych DNA można także wykorzystywać kationowy detergent