8851686591

17

I. Izolacja materiału genetycznegojako punkt wyjścia w procedurach molekularnych

Do określenia czystości i jakości izolatu DNA służy wyznaczenie współczynnika ab-sorbancji mierzonych przy długościach fal: 260 i 280 nm. Stosunek A260/A280 powinien mieścić się w zakresie 1,7—2,0. Znaczne odchylenia od tego zakresu mogą wskazywać na degradację kwasu (zwłaszcza w przypadku izolacji wysokocząsteczkowego DNA) oraz na zanieczyszczenie go odczynnikami organicznymi lub przez RNA. Zanieczyszczenie fenolem, często obecne w preparatach DNA pochodzących z ekstrakcji fenolowo-chloroformowej, powoduje wzrost absorbancji przy długości fali 270 nm. Dodatkową metodą wizualizacji i oceny jakościowej izolatów DNA jest elektroforeza w niskoprocentowych żelach agarozowych (np. 0,45%). Wysokocząsteczkowy DNA genomowy powinien być widoczny w postaci jednolitych prążków lub smug w początkowych odcinkach ścieżek żelu. W przypadku DNA plazmidowego możliwe jest rozróżnienie konformacji plazmidów. Forma OC migruje w żelu wolniej od formy superskręconej (CCC) i zlinearyzowanej.

4. Ekstrakcja RNA

Komórka eukariotyczna zawiera zazwyczaj około 10^-5 jJLg (10—30 pg) całkowitego RNA. Przeważającą frakcją RNA jest rybosomalny RNA (28S, 18S, 5,8S, 5S rRNA) stanowiący 80—85% całkowitego RNA. Na resztę składają się głównie niskocząsteczkowe frakcje tRNA, snRNA i scRNA. Informacyjny RNA stanowi zatem, w zależności od typu i stanu metabolicznego komórki, tylko 1—5% całkowitego RNA komórki. Jest to frakcja bardzo heterogenna złożona z cząsteczek o wielkości od kilkuset do kilku tysięcy nukle-otydów (średnio 1900). W pojedynczej komórce ssaków ogólna ilość mRNA utrzymuje się na poziomie około 360 tysięcy cząsteczek, co odpowiada około 12 000 rodzajów tran-skryptów — produktów ekspresji genów komórkowych. Także kopijność transkryptów poszczególnych genów jest bardzo heterogenna i może stanowić, w zależności od aktywności transkrypcyjnej genu, od mniej niż 0,01 do 3% całkowitego mRNA w komórce. Geny ulegające ekspresji na najwyższym poziomie mogą być transkrybowane na poziomie rzędu nawet 12 000 kopii mRNA na jedną komórkę, podczas gdy geny o bardzo niskiej ekspresji mogą być źródłem zaledwie 5—15 kopii mRNA. Geny ulegające tak niskiej ekspresji są jednak najczęstsze w genomie typowej komórki eukariotycznej. Typowa komórka ssaka zawiera aż 11 000 różnych rodzajów transkryptów takich genów, co stanowi 45% całkowitej puli mRNA. Średnia ekspresja genu oznacza zazwyczaj obecność 200^100 kopii mRNA w komórce. W materiale biologicznym, oprócz RNA komórkowego, może być obecny także RNA wirusowy zarówno jako produkt ekspresji genów wirusowych, jak i genom niektórych wirusów (np. retrowirusy, flawiwirusy itp.).

Podstawowym problemem izolacji RNA jest znacznie większa w porównaniu z DNA nietrwalość tego kwasu nukleinowego. Głównym problemem odróżniającym izolację RNA od izolacji DNA jest więc szybkość degradacji kwasu rybonukleinowego. Niestabilność RNA wynika zarówno z jego budowy (znacznie większa podatność wiązania fosfodiestrowego na hydrolizę w przypadku rybozy niż deoksyrybozy obecnej w DNA — zwłaszcza w środowisku alkalicznym), jak i z obecności w środowisku rybonukleaz (RNaz). Źródłem RNaz są zarówno czynniki zewnętrzne (szkło i sprzęt laboratoryjny, powierzchnia skóry, odczynniki itp.), jak i wnętrze komórki (RNazy endogenne). Inakty-wacja RNaz nastręcza znacznie większych trudności niż dezaktywacja DNaz. RNazy są bardzo trwałymi enzymami, nie są zależne od kofaktorów (np. jonów dwuwartościowych) i wykazują wysoką aktywność nawet w niewielkich stężeniach. Zahamowanie aktywności