8851686602

I. Izolacja materiału genetycznego jako punkt wyjścia w procedurach molekularnych

Daniel Sypniewski, Ilona Bednarek

1. Izolacja DNA

W przypadku izolacji kwasu dezoksyrybonukleinowego dobór odpowiedniej metody izolacji uzależniony jest od tego, jaką frakcję DNA chcemy uzyskać w wyniku ekstrakcji z materiału biologicznego. Najczęściej izoluje się genomowy lub plazmidowy DNA. Ogólna procedura jego izolacji polega na przeprowadzeniu w standardowych warunkach kilku etapów, do których zalicza się:

•    dezintegrację komórek,

•    oddzielenie DNA od lizatu komórkowego,

•    oczyszczanie DNA.

Jeśli materiałem wyjściowym są fragmenty tkanek (np. bioptaty) etapem wstępnym izolacji jest homogenizacja, która może mieć charakter homogenizacji mechanicznej (np. w homogenizatorze) bądź enzymatycznej, poprzez trawienie zrębu lącznotkankowego za pomocą proteinazy K lub innej proteazy. Bardzo dobrą metodą homogenizacji tkanek — ze względu na doskonale zabezpieczenie DNA przed degradacją — jest rozcieranie tkanki w ciekłym azocie.

Celem homogenizacji tkanek, a następnie dezintegracji komórek, jest uzyskanie liza-tów komórkowych, z których następnie będzie izolowany DNA. Stosowane w tym celu metody muszą być odpowiednio delikatne, aby nie nastąpiła fizyczna lub chemiczna degradacja DNA — uwaga ta dotyczy zwłaszcza wysokocząsteczkowego DNA genomowego. Dezintegracja tkankowo-komórkowa może być przeprowadzana metodami fizycznymi. W tym celu można zastosować wspomniane wcześniej rozcieranie komórek w ciekłym azocie, bądź użyć różnego typu homogenizatorów. Rozbicie komórek następuje także po zadziałaniu na nie szoku osmotycznego. W przypadku materiału roślinnego często stosowana jest technika rozcierania komórek z żelami krzemionkowymi, drobnymi kuleczkami szklanymi (gloss beeds) lub z piaskiem. Środkami chemicznymi wykorzystywanymi do lizy komórek są najczęściej łagodne detergenty jonowe lub niejonowe. Detergentami niejonowymi stosowanymi w izolacji DNA są zwykle Triton X-100, Brij 58, Nonidet P-40, Tween 20. Najczęściej używanym detergentem jonowym jest SDS (siarczan dodecylu sodu) lub związek o bardzo podobnej budowie i lepszej rozpuszczalności w wodzie - sarko-zyl. Bardziej radykalne metody lizy wykorzystują zastosowanie alkaliów (tzw. liza alkaliczna - w zakresie pH około 12) lub wysokiej temperatury (tzw. boiling lysiś). W przypadku komórek drożdży i bakterii można zastosować trawienie ścian komórkowych odpowiednimi enzymami degradującymi biopolimery obecne w strukturach ścian. W przypadku bakterii stosuje się komercyjnie dostępne preparaty lizozymu rozkładającego sieci pepty-doglikanu. Do rozkładu chityny budującej ścianę komórek drożdży stosowane są zymola-