8851686593

19

I. Izolacja materiału genetycznegojako punkt uyjścia w procedurach molekularnych

one być odpowiednio przygotowane i ochłodzone w ciekłych azocie, aby zapobiec degradacji uwalnianego z komórek RN A.

Stosowane obecnie metody izolacji RNA bazują w ogromnej większości przypadków na klasycznej metodzie ekstrakcji fenolowo-chloroformowej z użyciem soli chaotro-powych (izotiocyjanian guanidyny) opracowanej przez Chomczyńskiego i Sacchi w 1987 roku. Sole chaotropowe — izotiocyjanian (rodanek) guanidyny, chlorowodorek guanidyny, tiocyjanian amonu — są związkami stosowanymi w wysokich stężeniach, o właściwościach denaturujących białka (niszczą strukturę przestrzenną białek). Sole chaotropowe są jednocześnie czynnikami denaturującymi białka (działanie odbialczające), ułatwiającymi rozpad błon komórkowych oraz, co istotne, stanowią jedne z najsilniejszych inhibitorów RNaz. Możliwe jest oczywiście otrzymywanie bardzo czystych izolatów RNA w wyniku ultrawi-rowania w gradiencie chlorku cezu, jednak ze względu na małą dostępność odpowiedniego sprzętu (wysoki koszt ultrawirówek), a przede wszystkim na czas wykonania izolacji, metoda ta jest obecnie niemal zupełnie niestosowana. Należy jednak podkreślić, iż metoda ultrawirowania pozwala uzyskać nieosiągalną innymi sposobami czystość izolatu RNA. Najlepsze wyniki można osiągnąć, stosując ultrawirowanie w gradiencie chlorku cezu liza-tów powstałych z wykorzystaniem soli guanidyny. Metoda Chirgwina i współpracowników polega na ultrawirowaniu homogenatów tkankowych lub komórkowych z użyciem 4-molowego izotiocyjanianu guanidyny. Metody ultrawirowania opierają się na zjawisku sedymentacji RNA w gradiencie chlorku cezu (gęstość RNA w CsCl wynosi ok. 1,8 g/ml — jest znacznie wyższa niż gęstość pozostałych składników komórkowych). Zdenaturowa-ne białka oraz DNA pozostają w lizacie lub ulegają flotacji. Nowatorstwo metody Chomczyńskiego i Sacchi polegało na połączeniu zalet wykorzystania soli chaotropowych ze stosowaną dotychczas bez powodzenia (z powodu degradacji RNA) ekstrakcją fenolowo-chloroformową. Metoda nazywana w skrócie AGPC (acid-guanidinium tlńocyanatephenol-chloroform) jest jednostopniowa, szybka, tania i pozwala na jednoczesną izolację RNA z wielu próbek. Jedynymi ograniczeniami ekstrakcji AGPC, które mogą w skrajnych przypadkach uniemożliwić izolację RNA odpowiedniej jakości, są: dość wysoka zawartość polisacharydów i proteoglikanów w otrzymanych ekstraktach oraz mała wydajność ekstrakcji RNA z tkanek o wysokiej zawartości triglicerydów (np. tkanka tłuszczowa). Są to jedyne właściwie mankamenty, które niekiedy wymuszają użycie metod opartych na ultrawirowaniu zamiast ekstrakcji fenolowo-chloroformowej.

W klasycznej metodzie AGPC wg Chomczyńskiego i Sacchi liza komórek przeprowadzana jest w roztworze lizującym (roztwór D) zawierającym 4 M izotiocyjanian guanidyny, 0,5% sarkozyl jako detergent, (3-merkaptoetanol jako dodatkowy czynnik deprote-inizujący (zrywanie mostków disiarczkowych) oraz cytrynian sodu stabilizujący pH roztworu. W kolejnym etapie dodawane są kolejno: octan sodu (pH=4,0), fenol nasycony wodą (pH=4,0) i mieszanina chloroform-alkohol izoamylowy. Kwaśne pH fenolu zapewnia ekstrakcję DNA do warstwy organicznej, podczas gdy RNA pozostaje w fazie wodnej. Zdenaturowane białka pozostają bądź na granicy faz, bądź przechodzą do fazy organicznej.

Klasyczna metoda AGPC stała się podstawą do opracowania w latach 90. XX wieku wielu komercyjnie dostępnych metod wykorzystujących zwykle gotowe mieszaniny fenolu z solami chaotropowymi. Są to mieszaniny jednofazowe, w których fenol jest solubilizo-wany odpowiednimi dodatkami (np. glicerolu). Najbardziej znane i najpowszechniej sto-