8857685802

Mutantów RNAi w Git

Kodujących Warianty Histc

onu HI

odwrotnej transkryptazy (w ćwiczeniu oznaczona „-RT”) lub amplifikując sekwencję zawierającą intron. O czystości próbki wyizolowanego RNA świadczy także stosunek absorbancji przy długościach fali 260 oraz 280 nm. Dla czystego RNA A₂₆₀/A_2g0 wynosi 2 i ulega zmniejszeniu w obecności zanieczyszczeń (DNA, fenol, białka).

Jakość (np. czy wystąpiła degradacja) oraz ilość RNA można ocenić na podstawie elektroforezy w żelu agarozowym (Rys.l).

Odwrotna transkrypcja

— 25S

H-^18S

-,6S

Rys. 1 Żel agarozowy całkowitego RNA z Arabidopsis ihaliana.

cDNA, co można stwierdzić dzięki wewnętrznej kontroli (PCR z primerami specyficznymi do genu eksprymowanego konstytutywnie, np. aktyny). Liczba cykli w półilościowym PCR musi być ustawiona tak, aby zachować liniowość przyrostu produktów w kolejnych cyklach.

Za pomocą metody półilościowego PCR należy sprawdzić, czy uzyskane rośliny transgeniczne mają obniżony poziom transkryptów trzech wariantów histonu HI.

Dzień 1. Izolacja całkowitego RNA

Podczas izolacji RNA należy pamiętać o tym, że zanieczyszczenie próbki może się wiązać z wprowadzeniem RNAz (głównie z naskórka rąk), a więc z degradacją RNA i niepowodzeniem całej procedury.

Reakcję odwrotnej transkrypcji prowadzi się najczęściej przy użyciu primera oligo(dT) (Rys. 2a), który jest komplementarny do fragmentu poliA na 3'-końcu cząsteczek mRNA. Zastosowanie primera oligo(dT) pozwala na uzyskanie puli cDNA odpowiadającej całemu mRNA znajdującemu się w komórce (poza nielicznymi wyjątkami - m.in. mRNA wariantów histonów których transkrypcja zależna jest od syntezy DNA). W szczególnych przypadkach (np. brak poliA w analizowanym mRNA, analiza innych klas RNA) stosuje się przypadkowe primery heksamerowe (Rys. 2b), które dają jednakową reprezentację całego RNA komórkowego, lub też primer specyficzny do określonej sekwencji (Rys. 2c).

Do oceny jakości uzyskanego cDNA służy reakcja kontrolna PCR z użyciem primerów specyficznych do genu eksprymowanego konstytutywnie, np. aktyny.

Materiały:

-    rośliny Col-0, hl-RNAi (linie DSl-4-X lub DS1-21-15-X)

-    moździerze (chłodne)

-    tipsy (wolne od RNAz)

-    rękawiczki (wolne od RNAz)

-    vortex

-    wirówka Odczynniki:

-    bufor EB pH= 9.5

IM glicyna lOOmM EDTA lMNaCl fenol

mieszanina fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (24:24:1) chloroform

H₂0 milliQ (wolna od RNAz)

3M NaAc pH 5.2 izopropanol (-20°C) etanol (-20)

7,5g

20ml- 0,5M EDTA 20ml- 5M NaCl

9

X

Półilościowy RT-PCR

Terminem tym określa się metodę, w której porównuje się ilość dwóch lub więcej cząsteczek RNA z jednej lub większej ilości izolacji, przy czym ilość transkryptu szacuje się na podstawie ilości produktu PCR powstałego na matrycy cDNA. Aby możliwe było oszacowanie poziomu ekspresji, w porównywanych reakcj ach PCR

musi się znajdować ta sama ilość ^Ry^{s 2} Schemat reakcji odwrotnej transkrypcji użyciem różnych typów

oligo(dT)

-AAAAAAAAAAAA.

TTTTTTTTT

b)

c)

(m)RNA

-^AAAAAAAAAAAA..)

NNNNNN NNNNNN

(m)RNA

-(AAAAAAAAAAAA..)

er specyficzny

pnmerow