8857685816

Przygotowanie żelu do SDS PAGE

3.

Materiały:

-    2 przekładki (spacers) grubości 1 mm

-    szklana płytka

-    porcelanowa płytka

-    caster clamp

-    caster

-    2 czarne śruby

-    2 czerwone klipsy

-    grzebień o grubości 1 mm

-    kalka studzienek

-    aparat do elektroforezy

-    zasilacz Odczynniki:

-    mieszanina monomerów (30% akrylamid, 0.8% bisakrylamid)

-    1.5 M Tris-Cl pH 8.8

-    0.5 M Tris-Cl pH 6.8

-    10% SDS

-    woda destylowana

-    10% APS (ammonium persulfate)    ^

-    TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine)

-    butanol nasycony wodą

-    bufor SDS-PAGE (25 mM Tris, 192 mM glicyna, 0.1% SDS pH8.3)

-    roztwór utrwalający (7% kwas octowy, 40% metanol)

-    roztwór barwiący: (0,025% Coomassie Brillant Blue G-250 w 10% kwasie octowym)

-    roztwór odbarwiający (10% kwas octowy, 25% metanol)

-    komercyjny ekstrakt histonów rdzeniowych

-    Standard (marker) wielkości białek

Wykonanie

1. Przetrzyj szklane szybki i porcelanowe płytki metanolem lub acetonem.

2. Włóż po bokach - pomiędzy szybkę a płytkę przekładki (rys.2) i umieść w statywie (casting clamp - rys.3). Wcześniej upewnij się, że na statywie nie zostały resztki zaschniętego akrylamidu.

Dokręć śruby aż poczujesz lekki opór (zbyt mocne dociśnięcie    może

spowodować    pęknięcie

szybki).

Wstaw do podstawki (casting cradle) i dociśnij

do silikonowej gumy w podstawie poprzez przekręcenie do góry czarnych śrub.

5.    Przygotuj mieszaninę dla żelu rozdzielającego:

12% żel rozdzielający:

-    3 ml mieszaniny monomerów (30% akrylamid, S

0.8% bisakrylamid);    (3,75 ml dla 15%)

-    1.8 ml 1.5M Tris-Cl pH 8.8

-    75 pl 10% SDS

-    2.625 ml wody;    (l,88ml dla 15%)

-    75 pl 10% APS (ammonium persulfate)    _

-    7,5 pl TEMED (N,N,N',N'Tetramethylethylenedi ^ aminę)

-    Katalizatory (APS i TEMED) dodaje się tuż przed wylaniem mieszaniny pomiędzy szyby

6.    Od razu po dodaniu katalizatorów polimeryzacji roztwór dokładnie, ale delikatnie wymieszaj (unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza) i wiej pomiędzy przygotowane szybki pozostawiając 3-4 cm na żel rozdzielający.

7.    Nałóż warstwę (ok.2-3 mm) nasyconego wodą butanolu i pozostaw do polimeryzacji na co najmniej 30 min.

8.    Delikatnie usuń bibułą butanol i osusz szybki.

9.    Wlej żel zatężający i włóż grzebień pomiędzy szybki. Grzebień trzeba umieścić tak, by w studzienkach nie było pęcherzyków powietrza. Żel jest gotowy do użycia po ok.

20 - 30 minutach.

4.