9524124392

Autoreferat dr Tomasz Gosiewski

Publikacja nr 2

(badania nad wpływem hemu na aktywność wybranych enzymów polimeraz oraz wybór najmniej wrażliwego na inhibicję)

Amplifikacja DNA przy pomocy metody PCR pozwoliła na rewolucję w dziedzinie biologii molekularnej oraz w diagnostyce medycznej. Metoda pozwala na bardzo szybkie namnożenie materiału genetycznego w ilościach takich, że możliwa jest jego dalsza analiza, np. sekwencjonowanie czy detekcja markerów genetycznych obecności konkretnych drobnoustrojów w badanym materiale. Kluczowym elementem każdej amplifikacji PCR jest enzym termostabilnej polimerazy DNA. Jak każdy enzym, ma on swoją kinetykę działania zależną od warunków prowadzenia reakcji enzymatycznej (tutaj amplifikacji DNA). Enzymy polimeraz są wrażliwe na inhibitory, z których najbardziej istotnym jest hem, blokujący aktywność katalityczną polimerazy DNA. Hem jest istotnym składnikiem hemoglobiny, która znajduje się w dużych ilościach we krwi. W literaturze można odnaleźć doniesienia na temat różnego rodzaju preparatyki próbek krwi, aby wyeliminować efekt inhibicji PCR. Zazwyczaj są to sposoby polegające na dokładnym przepłukiwaniu próbek czy też ich rozcieńczaniu lub dodawaniu do mieszaniny reakcyjnej np. albuminy wołowej (BSA), glicerolu czy dekstranu lub innych substancji ochronnych, które stanowią dla inhibitorów dodatkowy cel i zmniejszają ich oddziaływanie na polimerazę.

Celem pracy była ocena przydatności termostabilnych polimeraz DNA w celu wybrania najbardziej odpornego na działanie hemu. Jednocześnie sprawdzono czy suplementacja mieszaniny reakcyjnej substancjami ochronnymi wpływa na aktywność enzymatyczną polimeraz.

W badaniach wykorzystano DNA szczepu wzorcowego Escherichia coli ATCC25922, którego DNA było amplifikowane oraz zestaw komercyjnych enzymów polimeraz DNA z aktywnością egzonukleazy (5' —» 3'): JumpStart Taq (Sigma); Hybrid (EURx); Perpetual Taq (EURx); Tfl (EURx); Tth (EURx); Tbr (FINNZYMES). Amplifikację prowadzono w czasie rzeczywistym przy użyciu aparatu CFX96 (BioRad). Badanie polegało na amplifikacji 1 pl (2,5 ng/ml) DNA E. coli przy pomocy polimeraz w wytworzonym gradiencie stężenia hemu (Sigma) (0 mM - 1,0 mM). Miarą aktywności enzymów był stosunek czułości reakcji (wyrażony wartością parametru Ct¹) w danym stężeniu hemu do czułości w próbce kontrolnej (bez hemu). Kolejnym etapem badania była analiza wpływu siedmiu substancji o potencjale ochronnym (w gradiencie ich stężenia 0% - 2%) na czułość

16

1

Cii tj. numer cyklu reakcji w którym liniowy P.r/yrost produktu pr/cciglustalong linię baam i)_

Kraków, 2015