9524124394

Autoreferat dr Tomasz Gosiewski

nukleinowych bakterii czy grzybów, których miana we krwi są bardzo niskie. Różne gatunki tych drobnoustrojów, charakteryzują się zróżnicowaną podatnością na liżę komórek, z uwagi na budowę ich ścian komórkowych i co za tym idzie, możliwością pozyskania z nich DNA. W literaturze naukowej brakuje opisu metod izolacji DNA z krwi skutecznej jednocześnie w przypadku bakterii, jak i grzybów. Wiele prac przedstawia metody sprowadzające się albo tylko do izolacji DNA eukariotycznego z leukocytów lub też osobno z bakterii albo tylko z grzybów, co wydłuża czas preparatyki próbki oraz zwiększa koszty.

Celem pracy było opracowanie kompleksowej metody izolacji DNA drobnoustrojów (bakterii i grzybów) niezależnie od typu budowy ściany komórkowej oraz uzyskanie izolatu o możliwie najwyższej czystości i stężeniu DNA drobnoustrojów. Wyniki badań zaowocowały nie tylko publikacją naukową, ale też uzyskaniem patentu na nowatorską metodę izolacji DNA drobnoustrojów z krwi (nr prawa wyłącznego: 219490).

W badaniach wykorzystano cztery szczepy wzorcowe, będące przedstawicielami grup drobnoustrojów zróżnicowanych pod względem budowy ściany komórkowej: Gram ujemna Escherichia coli ATCC25922, Gram dodatni Staphylococcus aureus ATCC33497, grzyb drożdżowy Candida albicans ATCC10231 i grzyb strzępkowy Aspergillus fumigatus ATCC14110, którymi sztucznie inokulowano jałową krew pochodzącą od zdrowych wolontariuszy, tak aby uzyskać liczbę ich komórek rzędu 10⁶ CFU/ml dla każdego z nich.

Opracowanie i standaryzacja metody izolacji DNA polegała na testowaniu różnych wariantów wstępnej preparatyki próbek krwi: (a) próbki poddawano lizie erytrocytów w roztworze 0,17 M chlorku amonu (Sigma) (równolegle izolowano DNA z pominięciem tego etapu, aby porównać wyniki); (b) stosowano dezintegrację mechaniczną w obecności szklanych kuleczek <|) 710 — 1180 pm (Sigma) w aparacie FastPrep (MP Biomedicals); (c) prowadzono liżę enzymatyczną bakterii w obecności enzymów lizozymu (2mg/ml), lizostafiny (0,2mg/ml) i litykazy 40U (Sigma) w temperaturze 37°C; (d) próbki poddawano działaniu 50 mM NaOH (POCh) w temperaturze 95°C. W dalszym etapie ze wstępnie spreparowanych próbek izolowano DNA przy wykorzystaniu komercyjnych zestawów (zgodnie z zaleceniami producentów): GeneMATRIX Quick Blood DNA Purification Kit (EURx); GeneJET (Fermentas); QIAamp DNA Blood (QIAGEN); Blood Mini (A&A Biotechnology); Genomie Mini (A&A Biotechnology). Zawartość DNA drobnoustrojów w próbkach wyznaczono za pomocą metody PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu specyficznych gatunkowo starterów i sond TaąMan oraz zestawu JumpStart Taq ReadyMix (Sigma), wyznaczając wartość Cy, tj. numer cyklu reakcji w którym liniowy przyrost

Kraków, 2015