9524124395

Autoreferat dr Tomasz Gosiewski

produktu przeciął ustaloną linię bazową. Wszystkie procesy amplifikacji prowadzono w termocyklerze CFX96 (BioRad). Stężenie oraz czystość izolatów całkowitego DNA w próbkach mierzono spektrofotometrycznie przy długości fal: 260 nm i 280 nm. Stężenie hemu w próbkach mierzono przy długości fali 388 nm. Pomiaru dokonano w izolatach uzyskanych z pełnej krwi oraz poddanych wstępnej hemolizie erytrocytów. Pomiar przeprowadzono przy pomocy aparatu NanoDrop (Thermo Scientific).

W wyniku przeprowadzonych badań opracowano metodykę izolacji DNA drobnoustrojów z krwi. Polegała ona na prowadzeniu wstępnej preparatyki próbek krwi celem odseparowania hemoglobiny z erytrocytów, a następnie na poddaniu pozostałego materiału (leukocyty i komórki drobnoustrojów) kolejnym etapom lizy mechanicznej (szklane kulki); enzymatycznej (lizozym, lizostafiny litykaza) oraz termiczno-chemicznej (roztwór NaOH i inkubacja w wysokiej temperaturze). Takie podejście zagwarantowało zniszczenie ścian komorowych zarówno bakterii Gram ujemnych oraz Gram dodatnich a także ścian grzybów drożdżowych i pleśniowych. Następnie oceniono, że najlepszym zestawem komercyjnym służącym do izolacji DNA ze spreparowanych próbek krwi były zestawy GeneMATRDC Quick Blood DNA Purification Kit (EURx) oraz Blood Mini (A&A Biotechnology). Kombinacja wstępnej preparatyki krwi oraz komercyjnego zestawu do izolacji DNA umożliwiła uzyskanie izolatów DNA o możliwie najwyższym stężeniu DNA badanych drobnoustrojów wzorcowych (ryc. 2) oraz o najniższym stężeniu hemu w próbkach DNA (ryc. 3).

Kraków, 2015