Medycyna Wet. 2007, 63 (7) 773
Artyk rz g d y
Szybkie metody identyfikacji mikroorganizmów
w żywnoS
ci
ANNA BZDUCHA
Zakład Oceny JakoS
ci ŻywnoS
ci Katedry BiotechnoIogii, MikrobioIogii i Oceny ŻywnoS
ci
Wydziału TechnoIogii ŻywnoS
ci SGGW, uI. Nowoursynowska 159c, 02-782 Warszawa
Bzducha A.
Rapid methods for microorganism identification in food
Summary
The need for the rapid and precise identification methods of food pathogens and spoilage microorganisms
requires the elaboration of new techniques of microbial diagnosis. This article presents the newest methods
of determining food biocontaminants with particular consideration given to immunological and genetic
techniques (genomics) as some of the instrumental techniques (MALDI-TOF-MS, GC-MS, GC-FID) which
classify microorganisms in respect to their specific chemical cell constituents, i.e. the fingerprint rule (proteomics,
lipomics).
Keywords: microorganisms, identification
Analiza żywności pod względem obecności mikro- z mechanizmów nabywania oporności przez mikroor-
organizmów patogennych i saprofitycznych jest jednym ganizmy pod wpływem stresowych warunków wzrostu.
z podstawowych narzędzi kontroli bezpieczeństwa i ja- Biorąc pod uwagę powyższy fakt, wiarygodność trady-
kości produktów spożywczych. Sprostanie standardom cyjnych metod posiewu staje się kwestią dyskusyjną.
Unii Europejskiej z zakresu zapewniania bezpieczeń- Zaobserwowano ponadto, że optymalizacja składników
stwa żywności, opracowanym w Białej Księdze w spra- podłoża oraz warunków inkubacji nie zwiększa istotnie
wie bezpieczeństwa żywności, 2000, oraz wymogom poziomu szybkiej regeneracji uszkodzonych komórek
monitoringu oraz zarządzania ryzykiem w łańcuchu żyw- (3).
nościowym (Rozporządzenie 178/2002 Parlamentu Przedstawione argumenty przemawiają za koniecz-
Europejskiego i Rady), zmusza do opracowywania no- nością stosowania w przemyśle spożywczym takich
wych, szybkich i pewnych metod identyfikacji zagro- metod diagnostycznych, które precyzyjnie oceniają ry-
żeń biologicznych. zyko obecności niepożądanej mikroflory w krótkim cza-
Dotychczas najczęściej stosowane w technologii żyw- sie. Badania mikrobiologiczne powinny rozpoczynać się
ności metody identyfikacji mikroorganizmów opierają od kontroli surowców, następnie przejść w kontrolę pro-
się na czasochłonnych i pracochłonnych technikach po- cesu produkcyjnego i systemu utrzymywania higieny
siewu, tj. zliczaniu kolonii mikroorganizmów wzrasta- linii technologicznej oraz opakowań, a docelowo anali-
jących na nieselektywnych i selektywnych podłożach. zy gotowego produktu. Procedury muszą wiarygodnie
Przetwórstwo surowców spożywczych opiera się głów- ocenić jakość mikrobiologiczną produktu, zanim trafi on
nie na fizycznych i chemicznych metodach utrwalania na rynek. Jest to jednocześnie realizacja założeń syste-
żywności (obniżanie pH środowiska, stosowanie wyso- mu HACCP i weryfikacja poprawności jego działania.
kich/niskich temperatur i ciśnienia, obniżanie aktywnoś-
Metody diagnostyki mikrobiologicznej
ci wody, dodatek substancji chemicznych i antybioty-
ków). Niekorzystne warunki środowiskowe stymulują Zapewnianie jakości i wiarygodności wyników ana-
mikroorganizmy do nabywania oporności. Stwarza to liz mikrobiologicznych na poziomie międzynarodowym
zagrożenie w zapewnianiu bezpieczeństwa żywności. pociąga za sobą konieczność akredytacji laboratoriów,
Badania naukowe potwierdzają, że niektóre patogeny walidację metod, stosowanie standardów wewnętrznych
żywności (np. z rodzaju Campylobacter) posiadają zdol- i automatyzację technik analitycznych, dzięki czemu
ność do tworzenia form nie dających wzrostu kolonii, wyniki stają się obiektywne i powtarzalne. Powtarzal-
mimo zachowanej aktywności metabolicznej, tzw. ność wyników jest czynnikiem gwarantującym popraw-
VBNC  viable but not culturable (8). Proces przecho- ność metody.
dzenia komórek w taki stan, regulowany na poziomie Zautomatyzowane lub manualne metody oznaczania
zmian genetycznych, jest prawdopodobnie jednym mikroorganizmów w żywności powinny charakteryzo-
774 Medycyna Wet. 2007, 63 (7)
wać się takimi atrybutami, jak m.in. szybkość oznacze- ny stanu higieny linii technologicznych, np. czystości
nia z jednoczesną gwarancją dokładności wyniku (mi- powierzchni produkcyjnych. Mierzona jest wówczas
nimalna liczba fałszywie negatywnych oraz fałszywie ogólna ilość ATP pochodzenia mikrobiologicznego, jak
pozytywnych wyników), zależna od czułości i precyzji i z pozostałości organicznych (15). Jednakże taki po-
metody. Testy diagnostyczne powinny być proste w wy- miar nie określa jednoznacznie aktywności metabolicz-
konaniu, możliwe do bezpośredniej integracji z syste- nej mikroorganizmów w badanej próbie.
mem monitoringu procesu przetwórczego, a stosowane I na koniec, do najprostszych sposobów można zali-
w nich odczynniki łatwo dostępne i stabilne podczas czyć wprowadzone udoskonalenia zliczania kolonii na
przechowywania. różnicujących podłożach, polegające na automatyzacji
Techniki fluorescencyjne i luminescencyjne. Szybki liczenia, a to dzięki dodawaniu do podłóż składników
postęp w rozwoju nauk związanych z biotechnologią umożliwiających m.in. pomiary fluorymetryczne.
(biochemii, biofizyki, chemii, immunologii, genetyki) Szybkie testy zmian metabolicznych. Opracowano
wpływa na stosowanie ich osiągnięć w analityce żyw- wiele zestawów pozwalających na szybką identyfikację
ności. Zwiększa się zainteresowanie metodami wyko- mikroorganizmów patogennych i saprofitycznych pod
rzystującymi nie tylko zdolność namnażania się mikro- względem charakterystycznych cech morfologicznych,
organizmów, ale ich kryteria identyfikacyjne (4). Kryte- fizjologicznych i biochemicznych. Zestawy te (kity) są
ria te opierają się najczęściej na wiedzy o podstawo- zminiaturyzowane, proste w wykonaniu i dają wynik
wych, niezbędnych do przeżycia, wymaganiach mikro- w krótkim czasie (6). Znane są m.in. testy API (Biome-
organizmów. riŁux), BBL Minitek system (Becton Dickinson Micro-
Techniki fluorescencyjne bazują, między innymi, na biological Systems), Biolog system (Biolog). Opierają
obecności nienaruszonej błony cytoplazmatycznej ży- się głównie na reakcjach chemicznych i biochemicznych
wych komórek, która jest barierą między cytoplazmą przeprowadzanych na gotowych podłożach wzrosto-
a środowiskiem zewnątrzkomórkowym. Mierzona jest wych z dodatkiem odpowiednich odczynników. Wyko-
spójność membrany na podstawie wybarwiania się rzystywana jest przy tym specyficzność przemian róż-
składników wewnątrzkomórkowych pod wpływem nych z
ródeł węgla przez mikroorganizmy oraz specyfi-
określonych barwników (propionian jodu, bromek ety- ka innych szlaków metabolicznych.
dyny, DAPI), np. DNA, przy czym proces wybarwiania Istnieją rozwiązana w pełni zautomatyzowane. Jed-
się zachodzi tylko w komórkach uszkodzonych. nakże użycie do analizy żywności rozwiązań tworzo-
Fluoroscencyjnie analizowane są również specyficz- nych głównie na potrzeby mikrobiologii klinicznej może
ne enzymy, gdzie substrat enzymu połączony z odpo- stwarzać trudności, wynikające ze złożoności składni-
wiednim barwnikiem, np. fluoresceiną, produkty bio- ków matrycy żywnościowej i ich interferencji ze skład-
syntezy wewnątrzkomórkowej, jak białka, lipidy, poli- nikami testów. Konieczna jest zatem adaptacja tych
sacharydy, kwasy nukleinowe, w tym rRNA (FISH  testów i stosowanie szczepów referencyjnych (6).
fluorescence in situ hybrydyzation) (8). Metoda FISH Pomiary zmian fizycznych w podłożu wzrostowym.
znajduje zastosowanie podczas detekcji mikroorgani- Dostępne są zautomatyzowane metody mierzące zmia-
zmów na poziomie taksonomicznym przy użyciu spe- ny fizyczne zachodzące w medium wzrostowym pod
cyficznych fluorescencyjnych oligonukleotydów rRNA wpływem rozwoju drobnoustrojów (przemian anabo-
i fluorescencyjnych antygenów (11). Do pomiaru licz- licznych i katabolicznych). Przykładem może być po-
by komórek znaczonych fluorescencyjnie wykorzysty- miar impedancji, opierający się na zmianie przewod-
wane są najczęściej optyczne sensory, jak mikroskopy ności (oporności) elektrycznej medium. System stoso-
fluorescencyjne czy cytometry przepływowe. wany jest do określania ogólnej liczby drobnoustrojów.
W ostatnim 15-leciu obserwowany jest znaczny Nie jest możliwa jego aplikacja do badań prób z małą
wzrost zainteresowania cytometrią przepływową. Ideą zawartością drobnoustrojów, ponadto istnieje prawdo-
oznaczenia jest pomiar pochłaniania wiązki światła la- podobieństwo wpływu matrycy żywnościowej na pra-
serowego przez znaczone fluorochromem składniki ko- widłowy przebieg oznaczenia (2).
mórki. Techniki optyczne połączone z fluorymetrią dają Kolejnym przykładem jest analiza zmian gęstości
odpowiedz
odnośnie do stanu fizjologicznego nawet po- optycznej podłoża, na której opierają się pomiary turbi-
jedynczej komórki, rozróżniają komórki martwe od ży- dymetryczne. W tym przypadku wielkość zmian skore-
wych, a łącznie z metodami separacji immunologicznej lowana jest z ogólną liczbą drobnoustrojów (15).
drobnoustrojów  dają wynik ilościowo specyficzny.
Biosensory
Czułość tych technik jest bardzo wysoka, np. możliwość
identyfikacji 102 komórek drożdży i 102-103 komórek W ostatnich latach zauważalny jest rozwój metod, któ-
bakterii w 1 ml próbki (11). Pewnego rodzaju ograni- rych narzędziami analitycznymi są biosensory reagują-
czeniem są koszty przyrządów pomiarowych. ce ze specyficzną sobie substancją obecną w środowis-
Do detekcji mikroorganizmów w żywności stosowa- ku reakcji. Wiele naturalnie występujących cząsteczek
ne są również metody opierające się na pomiarze lumi- zwanych bioreceptorami posiada właściwości  bioroz-
nescencji, np. ATP (adenozyno-5-trifosforan)  biolu- poznawalności . Należą do nich: antygeny, enzymy, re-
minescencja w kompleksie z lucyferazą, metody znako- ceptory komórkowe, kwasy nukleinowe, które stanowią
wania czynnikami luminescencyjnymi lub stosujące sub- podstawę projektowania biosensorów (20).
straty o takich właściwościach. ATP-bioluminescencja Biosensory immunologiczne. Sensory immunolo-
wykorzystywana jest przede wszystkim do szybkiej oce- giczne opierają się na charakterystycznym wiązaniu typu
Medycyna Wet. 2007, 63 (7) 775
antygen przeciwciało, które jest kompleksem specyficz- Czułość metody PCR zależy od liczby kopii powie-
nym. Czułość techniki zależy od stopnia powinowac- lonych fragmentów DNA, wieku kultury drobnoustro-
twa antygenu do przeciwciała, od sił wiążących oba jów, sposobu lizy komórki. Metoda PCR nie odróżnia
składniki oraz od wartościowości przeciwciała, tj. od materiału genetycznego komórek żywych od martwych.
liczby wiązań, które może utworzyć przeciwciało z an- W tym celu oznaczać można np. mRNA, jednakże for-
tygenami (2). Wyróżnia się dwie klasy oznaczeń immu- ma ta jest bardzo labilna i stąd trudna do detekcji. Roz-
nologicznych: homogeniczne i heterogeniczne. W pierw- wój metod genetycznych powinien dążyć do próby iloś-
szym typie nie stosuje się markerowego połączenia: ciowego oznaczania drobnoustrojów różnych gatunków
antygen przeciwciało, gdyż nie zachodzi konieczność jednocześnie (2).
rozdzielania przeciwciał skoniugowanych od niezwią- Inny rodzaj testów genetycznych to sekwencjonowa-
zanych z antygenem. Do oznaczeń heterogenicznych nie DNA chromosomalnego lub plazmidowego z wy-
konieczne jest znakowanie antygenów, np. enzymami korzystaniem enzymów restrykcyjnych i elektroforetycz-
lub barwnikami fluorescencyjnymi oraz oddzielanie nym rozdziale fragmentów na żelach (restriction lenght
przeciwciał niepołączonych od tworzących kompleksy fragment polymorphisms). Fragmenty te, po przeniesie-
z antygenami. Przykładowymi rozwiązaniami immuno- niu na membranę są poddawane hybrydyzacji ze zna-
analizy homogenicznej są lateksowe testy aglutynacyj- czoną sondą kwasu nukleinowego. Otrzymuje się wów-
ne, skonstruowane z cząstek lateksu, pokrytych warstwą czas obraz prążków specyficzny dla badanego gatunku
przeciwciał. Stosowane są do identyfikacji serologicz- lub szczepu. Kolejny przykład to sekwencjonowanie 16S
nej czystych kultur drobnoustrojów. W obecności od- rDNA i 16S-23S rRNA, jako wewnątrzgenowych re-
powiedniego substratu przebieg reakcji w układzie gionów różniących się wielkością i sekwencją nawet
pomiarowym jest łatwy do obserwacji, gdyż zachodzi wśród blisko spokrewnionych taksonomicznie grup (1).
widoczna aglutynacja. Wymienić można także testy Stosuje się wówczas również hybrydyzację sond DNA
immunodyfuzyjne, w których na matrycę żelową wzbo- lub RNA z komplementarnym fragmentem kwasu nu-
gaconą przeciwciałami nanosi się próbkę, a obecność kleinowego badanego drobnoustroju, również z zasto-
antygenów wywołuje w żelu strąt. Testem heterogenicz- sowaniem DNA Microarray Technology (genom chip),
nym jest ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays). tj. technologii macierzowej. Radioaktywne i fluorescen-
Czułość testów ELISA (104-106 jednostek/ml) zmusza cyjne markery pozwalają w tej metodzie na detekcję
często do wstępnego namnażania badanych drobnoustro- hybryd (6).
jów w próbkach o małej ich zawartości. Testy te nie dają
Instrumentalna analiza
odpowiedzi odnośnie do żywotności drobnoustroju.
składu komponentów komórkowych
Obiecujący jest rozwój produkcji zminiaturyzowa-
nych immunosensorów w formie mikrochipów i mikro- Drobnoustroje identyfikuje się również technikami
macierzy. opartymi na analizie składu biomarkerów, m.in. białek
Omawiając metody immunologiczne należy wspom- komórkowych, komórkowych kwasów tłuszczowych
nieć o możliwości wykorzystania wiązań typu przeciw- i ich estrów metylowych czy polarnych lipidowych kom-
ciało antygen jako sposobu fizycznej koncentracji i se- ponentów błony komórkowej. Chemiczna analiza me-
paracji specyficznych mikroorganizmów (z miesza- tabolitów może służyć do klasyfikacji taksonomicznej,
niny różnych drobnoustrojów) na matrycy materiałów nie jest ona jednak jeszcze często stosowana w analizie
pochodzenia organicznego. Stosuje się w tym celu, np. mikrobiologicznej żywności. Skład jakościowy związ-
izolację immunomagnetyczną na kulkach paramagne- ków chemicznych wchodzących w skład organelli ko-
tycznych pokrytych warstwą przeciwciał. Daje to moż- mórkowych, ich budowa oraz wzajemne stosunki iloś-
ciowe dają możliwość charakterystyki drobnoustrojów
liwość pominięcia długotrwałego etapu namnażania
drobnoustrojów przed ich identyfikacją dowolnymi tech- na zasadzie  odcisku palca . W komórkach bakterii,
nikami. drożdży i innych drobnoustrojów biomarkery komór-
Testy genetyczne (oparte głównie na badaniu kowe występują w niewielkich ilościach, stąd ich ozna-
DNA). Ostatnie dziesięciolecia możemy nazwać erą czanie musi być dokonywane w bardzo dokładnych urzą-
metod molekularnej identyfikacji materiałów biologicz- dzeniach pomiarowych. Nowoczesna, instrumentalna
analiza metabolitów jest bardzo czuła, szybka i ekono-
nych, różnicujących je genotypowo (genomics), np.
w przypadku drobnoustrojów na poziomie gatunku, ro- miczna pod względem wykorzystywanych odczynników
dzaju, szczepu. Postęp techniczny umożliwił podanie chemicznych. Możliwość stosowania takich rozwiązań
kompletnych informacji genetycznych (sekwencji DNA) w rutynowych badaniach spotyka się z coraz większym
szeregu mikroorganizmów. zainteresowaniem (7, 23). Najczęściej analiza instru-
Obecnie najpowszechniej stosowaną techniką gene- mentalna komórkowych związków strukturalnych sto-
tyczną wspomagającą identyfikowanie jest amplifika- sowana jest w mikrobiologii środowiskowej.
cja DNA metodą PCR  reakcja łańcuchowa polimera- Na tym tle niezbędne jest opracowywanie baz danych
zy. Metoda polega na transkrypcyjnym powielaniu spe- (bibliotek) z charakterystyką taksonomiczną szczepów
cyficznych fragmentów nici DNA lub RNA (500-3000 referencyjnych uwzględniającą wybrane komponen-
par nukleotydów) w cyklu reakcji z zastosowaniem od- ty komórkowe, np. profile kwasów tłuszczowych czy
powiednich sekwencji starterowych i enzymów polime- białek.
raz. Molekularne techniki identyfikacji mikroorganiz- Poza bazą danych Sherlock Microbial Identification
mów w żywności opisuje dokładnie Osek i wsp. (14). System (Newark, USA) z chemiczną specyfikacją ko-
776 Medycyna Wet. 2007, 63 (7)
mórek różnych gatunków i szczepów bakterii oraz Wiele wyników analiz wskazuje na wyjątkową precyzję
drożdży w mikrobiologii brak jest podobnych z
ródeł in- i skuteczność tej metody w szybkiej identyfikacji mi-
formacji. kroorganizmów.
Zadaniem analityków jest rozwój systemów o wyso- Efektywne stało się również połączenie spektrome-
kiej wydajności zbierania danych, ich przekazywania trii masowej z pirolizą (degradacja masy komórkowej
i automatycznego przetwarzania, które powinny być wysoką temperaturą), co pozwoliło wyeliminować
sprzężone z precyzyjnymi instrumentami analityczny- wstępne przygotowanie próbek przed analizą (9).
mi. Jest to konieczne do szybkiego monitoringu żyw- Analiza lipidów (lipomics). Badania nad charakte-
ności na zawartość drobnoustrojów. Komputerowa ana- rystyką składników lipidowych komórek mikroorga-
liza danych w odniesieniu do metod  odcisku palca nizmów dowodzą, że kwasy tłuszczowe, ich estry me-
opiera się na szczegółowej analizie statystycznej, tj. np. tylowe czy fosfolipidy membran komórkowych mogą
na szacowaniu indeksu podobieństwa, współczynnika być istotnym z
ródłem informacji w klasyfikacji drob-
korelacji, współczynnika odległości Euklidesa czy al- noustrojów, zarówno bakterii, jak i drożdży czy pleśni
gorytmie grupowania mikroorganizmów na podstawie i in. Analiza lipidów staje się przedmiotem zaintereso-
analizy najważniejszych (pod względem procentowej wań i badań analitycznych, dając, zdaniem wielu auto-
zawartości) komponentów spośród badanych związków rów, odpowiedz
porównywalną z metodami opierają-
chemicznych (7, 16), analizie składowych głównych cymi się na genetycznych wynikach badań (17).
(PCA  principal component analysis). Tłuszcze obejmują grupę związków odgrywających
Analiza białek (proteomics). Analiza składu białek główną rolę w wielu biochemicznych procesach komór-
komórkowych okazała się bardzo wiarygodna w klasy- kowych, stąd ważne jest poznanie wpływu zmienności
fikacji mikroorganizmów, daje bowiem informacje od- składników tłuszczowych na funkcjonowanie mecha-
nośnie do gatunku i szczepu. Białka są bezpośrednim nizmów metabolizmu komórkowego (10).
wynikiem ekspresji genomu komórkowego. Udowod- Kwasy tłuszczowe występują w komórkach przede
niono wysokie podobieństwo między zawartością bia- wszystkim w postaci estrów, jako trójglicerydy, fosfo-
łek komórki a hybrydyzacją DNA-DNA (7). Klasyczne lipidy, glikolipidy, sterole, będąc przede wszystkim
metody proteomics (analiza białek) służą precyzyjnej składnikami budulcowymi błony i ściany komórkowej
analizie białek, wykorzystują wysokorozdzielczą tech- oraz błon cytoplazmatycznych organelli komórkowych,
nikę dwuwymiarowej elektroforezy (2D-elektroforeza) np. mitochondriów, retikulum endoplazmatycznego,
połączoną, np. ze znakowaniem immunologicznym, spor, wolnych cząsteczek tłuszczów (17).
sekwencjonowaniem białek czy analizą aminokwasów. Fosfolipidy są obecne w membranach żywych komó-
Pozycja plam frakcji białkowych na żelu po 2D-elek- rek, nie występują natomiast jako tłuszcze zapasowe,
troforezie może być przesunięta na skutek np. wymiany ulegają szybkiemu rozkładowi w martwych komórkach,
pojedynczego aminokwasu w strukturze pierwszorzę- dlatego ich oznaczanie może służyć do określania ży-
dowej białka, dlatego sprzężenie 2D-elektroforezy ze wotności biomasy komórkowej.
spektrometrią mas umożliwia bardziej precyzyjną i pew- Analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych
ną identyfikację. Ponadto spektrometria mas (MS) umoż- czy fosfolipidów pozwala określić różnice międzyga-
liwia oznaczanie femtomolowych (10 10) ilości białek tunkowe z profilu tych związków. Możliwości te wyni-
(12). Jeszcze dokładniejszą identyfikację uzyskuje się kają z dużej różnorodności strukturalnej lipidów, tzn.
po wstępnym, enzymatycznym strawieniu kompleksu występowania kwasów tłuszczowych o różnej długości
mieszaniny białkowej, a następnie separacji peptydów łańcucha węglowego (dla mikroorganizmów zazwyczaj
za pomocą wysokosprawnej chromatografii jonowy- od C9 do C22), pozycji wiązań podwójnych lub ich
miennej i przeanalizowaniu końcowych wyników z za- braku, występowania izomerów cis- i trans-, obecności
stosowaniem detektora mas. pierścieni cyklicznych oraz rozgałęzień czy też podstaw-
Spektrometria mas jest wykorzystywana przede ników w łańcuchu alifatycznym (7). Przykładowo,
wszystkim do typowych analiz chemicznych. W wyni- Gram-dodatnie oraz beztlenowe Gram-ujemne bakterie
ku rozwoju sposobów przygotowania prób (desorpcja zawierają w przeważającej ilości rozgałęzione kwasy
plazmą, bombardowanie szybkimi atomami, elektro- tłuszczowe, natomiast tlenowe Gram-ujemne szczepy
sprej, desorpcja laserowa) możliwa stała się analiza cząs- charakteryzują się dużą zawartością mononienasyconych
teczek o większych ciężarach, będących komponenta- kwasów. W komórkach drożdży stwierdzono natomiast
mi komórkowymi żywych organizmów (10). Istnieją przewagę kwasów C16 i C18 (13, 17). Ponieważ nie
opinie, że opracowanie desorpcji laserowej z zastoso- wszystkie z analizowanych związków są charakterys-
waniem matrycy, na której istnieje możliwość wyzna- tyczne tylko dla jednej grupy mikroorganizmów, stąd,
czania mas cząsteczkowych białek, glikozydów, lipidów oprócz jakościowego składu lipidów, ważne są również
z próbek o femtomolowej zawartości analitu, jest jedną różnice w częstości występowania poszczególnych
z najlepszych obecnie znanych metod analitycznych. związków, ich ilości oraz wzajemne stosunki ilościowe
Analizowaną próbkę nanosi się na matrycę i poddaje (17).
napromieniowaniu impulsami laserowymi. Molekuły Skład ilościowy kwasów tłuszczowych, fosfolipidów
próbki ulegają jonizacji i desorpcji, tworząc chmurę gazu może ulegać zmianom pod wpływem środowiska, ak-
jonowego. Jony poddawane są detekcji w analizatorze tywności metabolicznej czy wieku drobnoustrojów (10).
czasu przelotu, gdzie następuje ich separacja, a następ- Do zapewnienia powtarzalności profilu składników li-
nie analiza zgodnie z masą cząsteczkową i ładunkiem. pidowych danego gatunku, szczepu konieczna jest stan-
Medycyna Wet. 2007, 63 (7) 777
daryzacja warunków wzrostu (tj. składu podłoża hodow- Instrumentalne techniki analizy chemicznej składników
lanego, jego pH i temperatury wzrostu), w których ozna- komórkowych są jedną z najbardziej obiecujących al-
czane mikroorganizmy stymulowane są do syntezy kwa- ternatyw spełniających wymagania wysokiej czułości
sów tłuszczowych. Zależność między kompozycją lipi- i dokładności z jednoczesnym szybkim wykonaniem
dów w komórkach bakterii czy drożdży a ich przyna- analizy.
leżnością taksonomiczną została doświadczalnie po-
PiS
miennictwo
twierdzona (17, 23). Różnice w profilu estrów metylo-
wych kwasów tłuszczowych rozdzielanych metodą chro- 1. Anon.: ISIAM 2000, A perspective on the fourth International Symposium
on the Interface between Analytical Chemistry and Microbiology, ISIAM 2000.
matografii gazowej były wystarczające do odróżnienia
J. Microb. Methods 2002, 48, 95-1000.
blisko spokrewnionych bakterii z rodziny Micrococca-
2. Boer E. de, Beumer R. R.: Methodology for detection and typing of foodborne
ceae (18). microorganismsm. Int. J. Food Microbiol. 1999, 50, 119-130.
3. Boulos L., Pr�vost M., Barbeau B., Coallier J., Desjardins R.: LIVE/DEAD
Najczęściej stosowanymi technikami identyfikacji
BacLight application of a new rapid staining method for direct enumeration
i różnicowania mikroorganizmów na podstawie skład-
of viable and total bacteria in drinking water. J. Microbiol. Methods 1999, 37,
ników tłuszczowych w komórce są: chromatografia ga- 77-86.
4. Breeuwer P., Abee T.: Assessment of viability of microorganisms employing
zowa z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (GC/
fluorescence techniques. Int. J. Food Microbiol. 2000, 55, 193-200.
FID) lub detektorem mas (GC/MS). Zastosowanie tych
5.Brondz I., Hłiland K., Ekeberg D.: Multivariate analysis of fatty acids in spores
technik wymaga przeprowadzenia estryfikacji lipidów
of higher basidiomycetes: a new method for chemotaxonomical classification
do ich lotnych estrów metylowych. Procedura zapropo- of fungi. J. Chromatogr. B 2004, 8000, 303-307.
6.Busse H.-J., Denner E. B. M., Lubitz W.: Classification and identyfication of
nowana przez Sassera (19) polega na zmydleniu tłusz-
bacteria: current approaches to an old problem. Overview of methods used
czów, a następnie przeprowadzeniu kwasowej mety-
in bacteral systematics. J. Biotechnol. 1996 47, 3-38.
lacji lipidów. Ekstrakt organiczny FAME (fatty acid 7. Giacomini M., Ruggiero C., Calegari L., Bertone S.: Artificial neural network
based identyfication of environmental bacteria by gas-chromatographic and elec-
methyl esters  estry metylowe kwasów tłuszczowych)
trophoretic data. J. Microb. Methods 2000, 43, 45-54.
poddawany jest analizie chromatograficznej. W powyż-
8. Gunasekera T. S., Słrensen A., Attfield P. V., Słrensen S. J., Veal D. A.: Induci-
szej metodzie wysoka temperatura stosowana podczas
ble gene expression by nonculturable bacteria in milk after pasteurization. Appl.
Envir. Microbiol. 2002, 68, 1988-1993.
zmydlania oraz metylacji może wpływać na występo-
9. Hendricker A. D., Abbas-Hawks C., Basile F., Voorhees K. J., Hadfield T. L.:
wanie strat bardziej lotnych estrów, tj. pochodnych kwa-
Rapid chemotaxonomy of pathogenic bacteria using in situ thermal hydrolysis
sów krótkołańcuchowych. Również niektóre komponen-
and methylation as a sample preparation step coupled with a field-portable mem-
ty mogą ulegać modyfikacjom, np. utlenianiu. Stoso- brane inlet quadrupole ion trap mass spectrometer. Int. J. Mass Spectr. 1999,
190/191, 331-342.
wanie łagodniejszych metod estryfikacji, np. łagodnej
10.Jones J. J., Stump M. J., Fleming R. C., Lay J. O., Wilkins C. L.: Strategies and
metylacji w pH zasadowym, może ograniczyć zafałszo-
data analysis techniques for lipid and phospholipid chemistry elucidation by
wanie wyniku analizy wspomnianymi stratami kompo- intact cell MALDI-FTMS. J. Am. Sos. Mass Spectrom. 2004, 15, 1665-1674.
11. Joux F., Lebaron P.: Use of fluorescent probes to assess physiological functions
nentów czy ich destrukcją.
of bacteria at single-cell level. Microbes Infection 2000, 2, 1523-1535.
Do analizy polarnych lipidów stosowana jest także
12.Jungblut P. R.: Proteome analysis of bacterial pathogens. Microbes Infections
technika HPLC/MS (wysokosprawna chromatografia
2001, 3, 831-840.
13.Moss C. W., Shinoda T., Samuels J. W.: Determination of cellular fatty acid
cieczowa sprzężona ze spektrometrią masową), która nie
composition of various yeast by gas chromatography. Jour. Clin. Microb. 1982,
wymaga przeprowadzania w lotne pochodne analizo-
1073-1079.
wanych związków  umożliwia ich identyfikację in sta-
14.Osek J., Kowalczyk A., Wieczorek K.: Molekularne metody wykrywania i iden-
tu nascendi. tyfikacji chorobotwórczych bakterii w żywności. Medycyna Wet. 2005, 61, 5-9.
15.Otero A., Garcia-Lopez M.-L., Moreno B.: Rapid microbilogical methods in
Prowadzone są także badania nad zastosowaniem
meat and meat products. Meat Science 1998, 49, 179-189.
spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera
16.Parente E., Ricciarrdi A.: A statistical procedure for the analysis of microbial
(FTIR) do identyfikacji różnych mikroorganizmów
communities based on phenotypic properties of isolates. J. Microb. Methods
2002, 49, 121-134.
z żywności na podstawie profilu estrów metylowych
17.Peltroche-Llacsahuanga H., Schidt S., L�tticken R., Haase G.: Discriminative
kwasów tłuszczowych. Whittaker i wsp. (21) potwier-
power of fatty acid methyl ester (FAME) analysis using the Microbial Identifi-
dzili możliwości różnicowania gatunków spośród Gram-
cation System (MIS) for Candida (Torulopsis) glabrata and Saccharomyces
cerevisiae. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2000, 38, 213-221.
-dodatnich i Gram-ujemnych bakterii.
18.Pendergrass S. M., Jensen P. A.: Application of the gas chromatography-fatty
acid methyl ester system for the identyfication of environmental and clinical
Podsumowanie
isolates of the family Micrococcaceae. Appl. Occup. Environ. Hyg. 1997, 12(8),
Klasyczne techniki identyfikacji mikroorganizmów 543-546.
19.Sasser M.: Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty
stosowane w przemyśle spożywczym nie są odpowied-
Acids. MIDI Technical Note 1990.
nie do prowadzenia szybkich, rutynowych analiz kon-
20.Tothill E. I.: Biosensors developments and potential applications in the agricul-
trolujących bezpieczeństwo i jakość żywności. Fakt ten
tural diagnosis sector. Computers Electronics Agric. 2001, 30, 205-218.
coraz częściej wymusza zastępowanie tradycyjnej iden- 21.Whitakker P., Mossoba M. M., Al-Khaldi S., Fry F. S., Dunkel V. C., Tall B. D.,
Yurawecz M. P.: Identyfication of foodborne bacteria by infrared spectroscopy
tyfikacji mikroorganizmów w żywności nowymi meto-
using cellular fatty acid methyl esters. J. Microb. Method 2003, 55, 709-716.
dami, umożliwiającymi uzyskanie wiarygodnego wyni-
22.Xu M., Basile F., Voorhees K. J.: Differentation and classification of user-speci-
ku w krótkim czasie. Dzieje się to dzięki automatyzacji fied bacterial groups by in situ thermal hydrolysis and methylation of whole
bacterial cells with tert-butyl bromide chemical ionization ion trap mass spec-
i komputeryzacji metod, stosowaniu standardów we-
trometry. Anal. Chim. Acta 2000, 418, 119-128.
wnętrznych i zewnętrznych oraz zestawianiu odmien-
23.Xu M., Voorhees K. J., Hadfield T. L.: Repeatability and pattern recognition of
nych technik analitycznych ze sobą. Dalszy rozwój diag- bacterial fatty acid profiles generated by direct mass spectrometric analysis of in
situ thermal hydrolysis/methylation of whole cells. Talanta 2003, 59, 577-589.
nostyki mikrobiologicznej powinien dążyć do opraco-
wywania metod szybkiego monitoringu w produkcji
Adres autora: mgr inż. Anna Bzducha, ul. Nowoursynowska 159c, 02-782
żywności (on-line) i w czasie rzeczywistym (real time). Warszawa; e-mail: [e-mail]