Kataliza enzymatyczna: oksydazy, katalaza, peroksydazy
Biochemiczne reakcje oksydoredukcyjne sÄ… podstawowymi procesami
dostarczającymi energii niezbędnej dla przemian w organizmach \
ywych. Poszczególne
ogniwa utleniania biologicznego są katalizowane przez ró\
norodne enzymy. Końcowy etap
utlenienia zachodzi w łańcuchu oddechowym.
1. Oksydazy
Enzymy te przenoszą wodór bezpośrednio na tlen atmosferyczny. Substratami są
często mono- i polifenole. Spośród oksydaz du\
e znaczenie praktyczne ma oksydoreduktaza
o-dwufenol: tlen (EC 1.10. 3.1) zwana potocznie oksydazÄ… fenolowÄ…, oksydazÄ… o-
dwufenolowÄ…, oksydazÄ… polifenolowÄ… (wielofenolowÄ…), tyrozydazÄ… lub katecholazÄ…. Enzym
ten jest metaloproteidem zawierającym w swoim składzie miedz
(ok. 0,2%), która przyjmuje
elektrony od fenoli i przekazuje na tlen cząsteczkowy. W wyniku działania enzymu o-
dwufenol przekształca się w o-chinon, a w wyniku dalszej kondensacji chinonów powstają
ciemno zabarwione produkty. Działaniu enzymu ulega równie\
fenol jednowodorotlenowy,
przy czym tworzy siÄ™ najpierw pirokatechina. Oksydaza fenolowa odgrywa du\
Ä… rolÄ™ w
przemyśle spo\
ywczym. Dzięki jej działaniu następuje ciemnienie przekroju rozciętego jabłka
lub ziemniaka, efektem jej działania jest tak\
e kolor czarnej herbaty, chleba razowego, a zbyt
du\
a jej aktywność mo\
e spowodować ciemnienie makaronu w czasie suszenia.
Sprzęt i odczynniki
- wyciąg ziemniaczany (ziemniaki, nó\
, tarka, płótno, zlewka),
- 1% roztwór fenolu,
- 1% roztwór pirokatechiny,
- 1% roztwór pirogallolu,
- statyw z probówkami, pipety.
Wykonanie doświadczenia
Przygotować wyciąg ziemniaczany przez umycie i obranie ziemniaka, utarcie na tarce
i wło\
enie do woreczka płóciennego, a następnie zanurzenie w zlewce z około 200 ml wody.
Zawartość zlewki łagodnie mieszać. Uzyskuje się wodny ekstrakt enzymów i skrobii; po
odwirowaniu przy niskich obrotach, ciecz nadosadowÄ… nale\
y zdekantować i u\
ywać do
doświadczeń.
Do probówek wlać po 5 ml wyciągu ziemniaczanego. Dodać do pierwszej probówki
10 kropli 1% fenolu, do drugiej - 10 kropli 1% pirokatechiny, a do trzeciej - 10 kropli
roztworu pirogallolu. Zawartości probówek zamieszać i obserwować zmiany zabarwienia.
Poniewa\
reakcja zachodzi dość długo, w międzyczasie nale\
y wykonać pozostałe
doświadczenia.
Wyniki doświadczeń
Notować w określonych odstępach czasu nasilenie barwy w probówkach
zawierających poszczególne fenole.
1
 Intensywność barwy Czas
Probówka
15 min. 30 min. 45 min. 60 min.
1. Z fenolem
2. Z pirokatechinÄ…
3. Z pirogallolem
2. Katalaza
Katalaza (1.11.1.6) jest nadzwyczaj szeroko rozpowszechnionym enzymem;
występuje u zwierząt, roślin i wszystkich bakterii tlenowych. Katalizuje reakcję rozkładu
nadtlenku wodoru do tlenu i wody według równania:
2H2O2 2H2O + O2
Katalaza jest metaloproteidem i w stanie krystalicznym zawiera 0,09% \
elaza, co
odpowiada czterem atomom Fe na cząsteczkę. Istnieje wiele inhibitorów katalazy. Sam
nadtlenek wodoru w większych stę\
eniach tak\
e powoduje inaktywacjÄ™ enzymu. HamujÄ…co
działa szereg substancji reagujących z \
elazem trójwartościowym koenzymu katalazy
(cyjanki, siarczki, azydki, fluorki, hydroksyloamina).
Sprzęt i odczynniki
- wyciÄ…g ziemniaczany (z podpunktu 1.),
- 3% H2O2,
- statyw z probówkami, pipety.
Wykonanie doświadczenia
Do 5 ml wyciągu ziemniaczanego dodać l ml 3% H2O2. Pod działaniem katalazy
następuje obfite wydzielanie tlenu.
Powtórzyć doświadczenie po uprzednim ogrzaniu wyciągu ziemniaczanego do
wrzenia (inaktywacja enzymu przez denaturację białka).
Wyniki doświadczeń
Doświadczenie Wynik Wniosek
Probówka 1
Probówka 2
3. Peroksydaza
Peroksydaza (EC. 1.11.1.7) jest enzymem bardzo rozpowszechnionym w roślinach;
występuje tak\
e u zwierząt i niektórych bakterii. Jej działanie, podobnie jak katalazy
związane jest z obecnością nadtlenku wodoru. Jednak nadtlenek nie jest rozkładany z
wydzieleniem tlenu, ale wykorzystywany jest przez enzym w reakcjach utleniania wielu
substratów - fenoli i amin aromatycznych.
Podobnie jak katalaza, koenzym peroksydazy zawiera \
elazo. Jest ona mało wra\
liwa
na wysokÄ… temperaturÄ™ i jeszcze w 100°C zachowuje częściowo swojÄ… aktywność.
2
 Przebieg typowej reakcji katalizowanej przez peroksydazę wyrazić mo\
na przy
pomocy schematu:
peroksydaza
AH2 + H O2 çÅ‚çÅ‚çÅ‚çÅ‚ A + 2H2O
2
Sprzęt i odczynniki
- jak w ćwiczeniu 1. i 2.
- 4% roztwór benzydyny w kwasie octowym.
3.1. Próba z fenolami
W przypadku korzystania z tego samego, co w przypadku oksydazy fenolowej, z
ródła
enzymu (sok ziemniaczany), tworzenie barwnych produktów następuje o wiele szybciej w
obecności nadtlenku wodoru, gdy\
równocześnie działają oksydazy i peroksydazy.
Wykonanie doświadczenia
Do probówek zawierających po 5 ml wyciągu ziemniaczanego wprowadzić po 10
kropli 1% roztworu fenolu, pirokatechiny i pirogallolu, a następnie po 10 kropli 3% H202,
Obserwować powstawanie barwy.
3. 2. Próba benzydynowa
Substancja, która mo\
e ulec utlenieniu pod wpływem działania peroksydazy w
obecności H2O2 mo\
e być benzydyna. Następuje wówczas przeniesienie tlenu z nadtlenku
wodoru na benzydynę i przekształcenie jej w błękit benzydynowy.
Wykonanie doświadczenia
Do 5 ml wyciągu ziemniaczanego dodać kroplę 4% roztworu benzydyny w
CH3COOH i kilka kropli 3% H2O2. Zanotować wyniki.
Opracowanie wyników badań
Podsumować i omówić uzyskane wyniki badań.
3