CHARAKTERYSTYKA SKROBI WYIZOLOWANEJ
Z ZIEMNIAKÓW I OCENA EFEKTYWNOŚCI
HYDROLIZY KWASOWEJ I ENZYMATYCZNEJ
KLEIKU SKROBIOWEGO
CHEMIA ŻYWNOŚCI
II ROK WNoŻiŻ
STUDIA NIESTACJONARNE
Autorzy opracowania:
dr inż. Dorota Piasecka-Kwiatkowska
dr inż. Bożena Stasińska
dr inż. Magdalena Zielińska-Dawidziak
Poznań 2008
Skrobia jest roślinną substancją zapasową, odkładającą się szczególnie obficie w
nasionach (ziarniaki zbóż, groch, fasola, bób) i bulwach (ziemniaki) w postaci ziaren
skrobiowych o wielkości od 2 do 150 �m. Praktycznie wszystkie produkty mączne i kasze są
z
ródłem skrobi. Stanowi ona ponad połowę węglowodanów spożywanych przez człowieka.
Pod względem chemicznym skrobia składa się z reszt ą-D-glukopiranozy powiązanych
ze sobą wiązaniami ą-1,4-glikozydowymi. Tylko w punktach rozgałęzień występują wiązania
ą-1,6-glikozydowe. Jest cukrem nieredukującym, zbudowanym z dwóch różnych strukturalnie
składników: amylozy i amylopektyny.
AMYLOZA stanowi na ogół 14-27% suchej masy skrobi, ma strukturę liniową, składa
się z licznych (250-1000) reszt D-glukopiranozy, połączonych wiązaniami
ą-1,4-glikozydowymi (ryc.1). Masa cząsteczkowa amylozy zawarta jest w granicach
10-200 kDa. Podstawową jednostką strukturalną jest maltoza, a pomiędzy jednostkami
maltozowymi występuje także wiązanie ą-1,4-glikozydowe. Cząsteczka amylozy nie jest
rozgałęziona, lecz tworzy łańcuch skręcony śrubowo, przy czym na jeden skręt spirali
przypada 6 reszt glukozy. Strukturę przestrzenną amylozy stabilizują wiązania wodorowe
formujące się między wolnymi grupami OH. Kształt cząsteczki amylozy ma wpływ na jej
reaktywność zarówno chemiczną, jak i biochemiczną. Amyloza reagując z jodem daje
intensywne niebieskie zabarwienie. Istota tego zjawiska polega na zagęszczaniu cząsteczek
jodu w wolnych przestrzeniach ograniczonych przez cząsteczki glukozy. Taki związek
wykazuje zmienione właściwości fizyczne (silną absorpcję światła).
CH2OH
CH2OH
O
O
1
4
1
4
& &
& &
O
O OH
OH
.
& &
& &
OH
OH
Ryc.1. Fragment wzoru amylozy
AMYLOPEKTYNA jest rozgałęzioną formą skrobi. Do łańcucha głównego
zbudowanego z reszt glukozowych powiązanych wiązaniem ą-1,4-glikozydowym są
przyłączone wiązaniem ą-1,6-glikozydowym łańcuchy boczne, które mogą się również
rozgałęziać. W cząsteczce amylopektyny na jedno wiązanie ą-1,6-glikozydowe przypada
około trzydzieści wiązań ą-1,4-glikozydowych. W skład cząsteczki amylopektyny obok
glukozy, której zawartość może sięgać aż do 2 milionów cząsteczek, niekiedy wchodzi pewna
ilość kwasu fosforowego, a masa cząsteczkowa zawarta jest w granicach 200-6000 kDa. Ze
2
względu na liczne rozgałęzienia amylopektyna przedstawia sferyczny, nieuporządkowany
kłębek, w którym jedynie zewnętrzne łańcuchy mogą wykazywać strukturę spiralną. Dlatego
amylopektyna daje z jodem zabarwienie fioletowe.
CH2O
O
4
1
& ...
O
O
O
CH2 CH2O
6
O
5 O
1
4 1
O4 O & &
O
O
2
3
O O
Ryc.2. Fragment wzoru amylopektyny
Obydwa składniki skrobi tworzą strukturę nadcząsteczkową, w której występują drobne
krystaliczne micele oraz struktury amorficzne powiązane mostkami wodorowymi.
Właściwości skrobi stanowią wypadkową właściwości obu jej składników i ich wzajemnego
stosunku ilościowego. Oprócz rdzenia węglowodanowego skrobia zawiera niewielkie ilości
białka (do 0,5%), lipidów (ok.0,9%) oraz fosforu (0,05-0,25%) i wiele innych składników
mineralnych. Zakłada się ponadto, że strukturalnym składnikiem skrobi jest woda. Jest ona
związana za pomocą wiązań wodorowych z grupami OH reszt glukozy.
Skrobia jest nierozpuszczalna w wodzie oraz w większości rozpuszczalników
organicznych. W zimnej wodzie ziarna skrobiowe pęcznieją i w określonej dla każdego
rodzaju skrobi temperaturze kleikują, tzn. tracą strukturę ziarnistą przechodząc w stan
bezpostaciowy. Zachodzi wtedy nieodwracalna dezintegracja makrocząsteczek i powstaje
lepki kleik. Amyloza skleikowanej skrobi jest rozpuszczalna w gorącej wodzie, a
amylopektyna ulega w tych warunkach pęcznieniu, stąd za lepkość kleików skrobiowych
odpowiedzialna jest przede wszystkim amylopektyna.
Skrobia skleikowana ulega retrogradacji. Zjawisko to polega na wytworzeniu
pomiędzy sąsiednimi cząsteczkami amylozy mostków wodorowych i powstaniu struktury
krystalicznej. Skrobia taka jest odporna na działanie enzymów i dlatego retrogradacja może
być w pewnych przypadkach zjawiskiem niekorzystnym. Retrogradacja skrobi jest również
przyczyną czerstwienia pieczywa oraz zmian struktury skrobiowych artykułów
żywnościowych. Zjawisku temu sprzyja duża zawartość amylozy w skrobi oraz obniżona do
ok. 0oC temperatura. Skrobia różnego pochodzenia wykazuje różną skłonność do
retrogradacji, np. skrobia ziemniaczana jest bardziej oporna na retrogradację niż skrobia
pszenna.
3
Ogrzewanie skrobi do temperatury 180-200oC prowadzi do depolimeryzacji
(dekstrynizacji) cząsteczki skrobiowej oraz do wytworzenia się w dekstrynach rozgałęzień
(np. powstają wiązania �-1,6-glikozydowe). Powstaje wówczas furfural i wiele substancji
lotnych, m.in. kwas octowy i mrówkowy, aldehyd octowy i inne.
W zależności od tego, czy skrobia znajduje się w postaci natywnej, tzn. w postaci
ziaren, czy też w formie rozpuszczonej (kleik skrobiowy), a więc częściowo fizycznie
zdezintegrowanej, różne są jej właściwości chemiczne. Skrobia natywna jest mniej reaktywna,
np. nie działają na nią (lub działają bardzo słabo) enzymy amylolityczne powodujące
hydrolizę skrobi.
HYDROLIZA SKROBI
HYDROLIZA KWASOWA
Skrobia pod wpływem kwasów ulega stopniowej hydrolizie przez stadium dekstryn do
maltozy i małej ilości glukozy. Pośrednimi produktami są: amylodekstryny, erytrodekstryny,
achro- i maltodekstryny oraz maltoza. W miarę hydrolizy wzrastają stopniowo właściwości
redukujące.
Ryc. 3. Schemat hydrolizy kwasowej skrobi
HYDROLIZA ENZYMATYCZNA
Hydroliza enzymatyczna skrobi przebiega przy udziale enzymów amylolitycznych. Jest
procesem, który znalazł szerokie zastosowanie w różnych gałęziach przemysłu spożywczego,
np. piekarskim, gorzelniczym, browarniczym. Amylazy należą do klasy hydrolaz, a więc
enzymów rozkładających wiązania glikozydowe przy równoczesnym włączeniu cząsteczki
wody. Enzymy amylolityczne występują w przyrodzie dość często, zarówno u roślin i
4
zwierząt, jak i w komórkach drobnoustrojów. Do najważniejszych enzymów należą: ą- i �-
amylaza oraz ą-glukozydaza.
ą-amylaza, tzw. amylaza dekstrynująca, jest endoglikozydazą. Hydrolizuje wewnętrzne
ą
ą
ą
wiązania ą-1,4-glikozydowe, dając maltozę, maltotriozę (maltodekstrynę) i ą-dekstrynę
(achrodekstrynę). W początkowej fazie hydrolizy ą-amylaza powoduje szybki rozkład wiązań
ą-1,4-glikozydowych długiego łańcucha amylozy do drobnocząsteczkowych dekstryn
(zawierających 6-7 reszt glukozy), które stopniowo podlegają dalszej degradacji do tri- i
disachrydów (maltoza) oraz w nieznacznym stopniu do glukozy. Enzym ten atakuje wiązania
glikozydowe, amylozy znajdujące się w środku łańcucha, rozkładając go na coraz mniejsze
fragmenty. W wyniku działania ą-amylazy na amylopektynę powstają różne rozgałęzione
łańcuchy, zawierające kilka reszt glukozy. Na skutek działania ą-amylazy spada lepkość
kleiku skrobiowego.
Ryc.4. Schemat działania ą
ą-amylaz.
ą
ą
�-amylaza, tzw. amylaza cukrująca, jest egzoglikozydazą. Hydrolizuje skrobię do
�
�
�
maltozy poprzez kolejne odłączanie dwóch reszt glukozy od nieredukujących końców
łańcucha glikozydowego, tworząc maltozę. Enzym ten nie rozkłada wiązań
ą-1,6-glikozydowych, dlatego amylozę rozkłada całkowicie (ryc. 5a), a amylopektynę tylko
w ok. 65%, pozostawiając  rdzeń amylopektynowy, tzw. dekstrynę graniczną, zawierającą
wszystkie rozgałęzienia (ryc. 5b). Enzym ten rozkłada więc tylko boczne łańcuchy
amylopektyny do maltozy, pozostawiając środkową część cząsteczki w postaci dużej
dekstryny granicznej. Dalsza hydroliza tej dekstryny jest możliwa tylko dzięki łącznemu
działaniu obu amylaz: ą-amylaza rozcinając od środka nierozłożoną część amylopektyny na
rozgałęzione fragmenty, powoduje jednocześnie uwolnienie się nowych odcinków łańcuchów
prostych, które mogą być wówczas rozłożone przez �-amylazę do maltozy. Dwucukier
maltoza jest następnie rozszczepiany przez ą-glukozydazę do glukozy. Na skutek działania
�-amylazy wzrasta redukcyjność kleiku skrobiowego.
5
a)
b)
dekstryna graniczna
Ryc.5. Schemat działania �-amylaz: a) na amylozę b) na amylopektynę
REAKCJE SKROBI Z JODEM
Obecność skrobi w próbie można stwierdzić na podstawie próby jodowej. W obecności
skrobi występuje charakterystyczne granatowe zabarwienie. Amyloza daje z jodem
zabarwienie niebieskie, zaś amylopektyna fioletowe. Amyloza o konfiguracji liniowej nie jest
zdolna do tworzenia kompleksu z jodem. Musi istnieć konfiguracja heliksu, aby cząsteczki
jodu mogły się w niej regularnie ułożyć. Jedna cząsteczka jodu przypada na sześć reszt
glukozowych, czyli na jeden skręt heliksu. Ogrzewanie kleiku skrobiowego powoduje
rozkręcanie się heliksu, co jest przyczyną zanikania niebieskiego zabarwienia z jodem.
Obserwując zmiany zabarwienia w trakcie wykonywania próby jodowej, można określić
stopień zhydrolizowania skrobi. W obecności amylodekstryn zabarwienie przechodzi w
fioletowe, erytrodekstryn w czerwone, achrodekstryn w pomarańczowe, natomiast
maltodekstryny, maltoza oraz glukoza nie dają z jodem barwy.
Na tworzenie barwnych kompleksów z jodem istotny wpływ ma pH środowiska. Skrobia
nie tworzy z jodem zabarwienia w środowisku zasadowym, gdyż jod przereaguje z zasadą
według równania:
I2 + 2NaOH NaIO + H2O + NaI
W środowisku kwasowym reakcja przebiega w kierunku odwrotnym:
NaIO + NaI + 2HCl 2NaCl + I2 + H2O
6
CEL ĆWICZENIA
1. Izolacja skrobi z ziemniaków.
2. Badanie właściwości skrobi.
3. Porównanie efektywności hydrolizy kwasowej i enzymatycznej kleiku
skrobiowego.
WYKONANIE ĆWICZENIA
1. IZOLACJA SKROBI Z ZIEMNIAKÓW
Obrane i umyte ziemniaki (ok. 3 sztuki) utrzeć na miazgę i dodać równą objętość wody,
zmieszać i przesączyć przez kilka warstw gazy. Przesącz rozcieńczyć 2-3 krotnie wodą i
zdekantować. Zlać ciecz znad osadu, skrobię zawiesić w etanolu i powtórnie zdekantować.
Następnie skrobię wysuszyć na powietrzu.
2. BADANIE ROZPUSZCZALNOŚCI SKROBI
Do około 1g skrobi dodać kilka cm3 wody, dobrze wymieszać i przesączyć przez bibułę.
Do przesączu wprowadzić kroplę roztworu I w KI. Zinterpretować.
3. PRZYGOTOWANIE KLEIKU SKROBIOWEGO
W zlewce zagotować około 75 cm3 wody. W drugiej zlewce sporządzić jednolitą
zawiesinę 1g skrobi w 15 cm3 zimnej wody, którą wlać do wrzącej wody ciągle mieszając.
Zlewkę po zawiesinie przepłukać 10 cm3 wody i dodać do wrzącego roztworu. Gotować do
całkowitego rozpuszczenia. Otrzymany opalizujący roztwór skrobi będzie wykorzystywany do
dalszych doświadczeń.
4. WYSALANIE SKROBI
Do 3 cm3 kleiku skrobiowego dodać 5 cm3 nasyconego roztworu (NH4)2SO4. Po 5 min
przesączyć i do przesączu dodać kroplę I w KI. Brak zabarwienia świadczy o całkowitym
wytrąceniu skrobi z roztworu. Zinterpretować.
7
5. WPA
YW WARUNKÓW ŚRODOWISKA NA PRZEBIEG REAKCJI SKROBI Z JODEM
" TEMPERATURA
Do 2 cm3 kleiku skrobiowego dodać kroplę roztworu I w KI. Powstaje niebieskie
zabarwienie. Probówkę ogrzać. Niebieskie zabarwienie znika. Po ochłodzeniu pod bieżącą
wodą zabarwienie powraca. Zinterpretować.
" pH ŚRODOWISKA REAKCJI
Do 2 cm3 kleiku skrobiowego dodać kilka kropli 1 M roztworu NaOH i kroplę roztworu I
w KI. Zabarwienie nie powstaje. Po zakwaszeniu kwasem solnym barwa pojawia się.
Zinterpretować.
6. HYDROLIZA KLEIKU SKROBIOWEGO
" KWASOWA
Do 12 cm3 roztworu kleiku skrobiowego dodać 3 cm3 stęż. H2SO4. Po zmieszaniu pobrać
próbkę do badania efektywności hydrolizy, a następnie ogrzewać we wrzącej łaz
ni wodnej. Co
3 minuty pobierać do analizy hydrolizat (patrz badanie efektywności hydrolizy).
" ENZYMATYCZNA
Do 13 cm3 roztworu kleiku skrobiowego dodać 2 cm3 roztworu enzymu. Bezpośrednio po
zmieszaniu pobrać próbkę do badania efektywności hydrolizy, a następnie inkubować w łaz
ni
wodnej o temperaturze 37oC. Co 3 minuty pobierać do analizy hydrolizat (patrz badanie
efektywności hydrolizy).
7. BADANIE EFEKTYWNOŚCI HYDROLIZY KWASOWEJ I ENZYMATYCZNEJ
KLEIKU SKROBIOWEGO
W dwóch statywach umieścić 2 szeregi probówek, w każdym po 5 sztuk. Jeden zestaw
posłuży do określenia stopnia rozkładu skrobi w trakcie hydrolizy kwasowej, a drugi
enzymatycznej. Bezpośrednio po rozpoczęciu hydrolizy, a następnie co 3 minuty przenosić,
po 1 cm3 odpowiedniego hydrolizatu do probówek pierwszego i drugiego szeregu,
znajdujących się w odpowiednim statywie. Do pierwszego szeregu dodać po 1 cm3 0,002%
roztworu I w KI i obserwować stopniowy zanik barwy. W drugim szeregu probówek
hydrolizat doprowadzić roztworem NaOH do pH ok. 8, dodać 3 cm3 odczynnika Benedicta i
wstawić do wrzącej łaz
ni wodnej na 5 min. Obserwować powstający pomarańczowy osad
Cu2O.
8