Aleksandra Bachanek 29.11.2012
Magda Dylewska
Ilona Niewęgłowska
Justyna Zarzeczna
OŚ 1
Sprawozdanie nr 2 z zajęć laboratoryjnych z biochemii
TEMAT: Ilościowe oznaczanie białka metodą Lowry’ego.
Oznaczanie białka w ściekach oczyszczonych, nieoczyszczonych i białka jaja kurzego
Metoda Lowry’ego oznaczania białka wykorzystuje czułą reakcję, jaką dają wiązania peptydowe i tyrozyna z odczynnikiem Folina-Ciocalteu. Jest kombinacją reakcji biuretowej oraz reakcji między resztami tyrozyny a tym odczynnikiem, w wyniku której powstają barwne (niebieskie) produkty. Absorbancję powstałego zabarwienia odczytuje się przy λ = 750nm.
Przygotowanie odczynnika miedziowego:
Na 30 minut przed oznaczeniem należy przygotować odczynnik miedziowy. W tym celu należy zmieszać 0,5 ml 2% roztworu siarczanu miedziowego, 0,5 ml 2% roztworu winianu sodowo-potasowego oraz 50 ml 2% roztworu Na2CO3 w 0,1 M roztworze NaOH.
Ścieki oczyszczone nierozcieńczone odmierzono do 2 probówek w ilościach 1 cm3,
0,5 cm3 i uzupełniono wodą destylowaną do 1cm3. Trzecia probówka (kontrolna) zawierała 1cm3 wody destylowanej. Później dodano 5 cm3 wcześniej przygotowanego odczynnika miedziowego i pozostawiono probówki na 10 minut. Następnie kolejno dodano 0,5 cm3 odczynnika Folina-Ciocalteu’a, przygotowanego wcześniej (mieszając 1 ml odczynnika Folina i 2 ml H2O) i pozostawiono na 30 minut. Po upływie tego czasu zmierzono absorbancję próbek przy długości fali λ=750nm stosując jako odnośnik próbkę zawierającą 1 cm3 wody destylowanej.
Ścieki nieoczyszczone nierozcieńczone odmierzono do 2 probówek w ilościach 0,2 cm3, 0,5 cm3 i uzupełniono wodą destylowaną do 1cm3. Trzecia probówka (kontrolna) zawierała 1cm3 wody destylowanej. Później postępowano jak w przypadku ścieków oczyszczonych.
Białko jaja kurzego rozcieńczono w stosunku 1:100. Następnie odmierzono do 2 probówek w ilościach 0,1 cm3, 0,2 cm3 i uzupełniono wodą destylowaną do 1cm3. Trzecia probówka (kontrolna) zawierała 1cm3 wody destylowanej. Dalsze kroki jak w przypadku ścieków.
Wzór na zawartość białka w wyciągu bezkomórkowym (Zb)
kg/cm3
gdzie:
a – średnia zawartość białka w trzech równoległych próbkach o objętości 1cm3 [μg]
10-9 – współczynnik przeliczeniowy zawartości białka z mikrogramów [μg] na kilogram [Kg]
| Objętość ścieków oczyszczonych | Absorbancja | Średnia (a) |
|---|---|---|
| 1 cm3 | 102,02 | [μg/cm3] |
| 0,5 cm3 | 52,858 | [μg/cm3] |
| 0 cm3 | 0 | [μg/cm3] |
Zb =a * 10-9 [kg/cm3]
Zb = 103,868 * 10-9 kg/cm3
Zb =1,04* 10-7 [kg/cm3]
| Objętość ścieków nieoczyszczonych | Absorbancja | Średnia (a) |
|---|---|---|
| 0,2 cm3 | 105,53 | [μg/cm3] |
| 0,5 cm3 | 223,31 | [μg/cm3] |
| 0 cm3 | 0 | [μg/cm3] |
Zb =a * 10-9 [kg/cm3]
Zb = 487,135 * 10-9 kg/cm3
Zb =4,87 * 10-7 [kg/cm3]
| Objętość białka jaja kurzego | Absorbancja | Średnia (a) |
|---|---|---|
| 0,1 cm3 | 158720 | [μg/cm3] |
| 0,2 cm3 | 139825 | [μg/cm3] |
| 0 cm3 | 0 | [μg/cm3] |
Zb =a * 10-9 [kg/cm3]
Zb = 1143170 * 10-9 kg/cm3
Zb = 1,14 * 10-3 [kg/cm3]
ścieki oczyszczone |
ścieki nieoczyszczone | białko jaja kurzego | |
|---|---|---|---|
| Zawartość białka | 1,04* 10-7 [kg/cm3] | 4,87 * 10-7 [kg/cm3] | 1,14 * 10-3 [kg/cm3] |
Wnioski:
W wyniku analizy trzech próbek: ścieków oczyszczonych i nieoczyszczonych oraz białka jaja kurzego stwierdzono, że największą zawartość białka wykazuje próbka zawierająca białko jaja kurzego. Zawartość białka w jaju kurzym jest rzędu 10-3 i jest dużo większa niż w ściekach, gdzie mamy do czynienia z rzędem 10-7. Porównują natomiast ścieki oczyszczone i nieoczyszczone zauważamy, że zawartość białka w nieoczyszczonych jest większa. Oczyszczanie ścieków eliminuje większość związków organicznych co wiąże się ze zmniejszeniem zawartości białka.