POLITECHNIKA GDAC
SKA
WYDZIAA
CHEMICZNY
KATEDRA CHEMII I TECHNOLOGII
MATERIAA
ÓW FUNKCJONALNYCH
Ćwiczenia laboratoryjne
z przedmiotu
CHEMIA I TECHNOLOGIA MATERIAA
ÓW BARWNYCH
pt.: ANALIZA I CHROMATOGRAFICZNE ROZDZIELANIE BARWNIKÓW
ROŚLINNYCH
GDAC
SK 2013
1
1. Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie Studentów ze strukturą i właściwościami ważnych,
powszechnie występujących w naturze barwników organicznych oraz nabycie przez
Studentów umiejętności izolacji tych związków z surowców roślinnych z
wykorzystaniem metod chromatograficznych.
2. Wprowadzenie
2.1. Karotenoidy
Wśród organicznych barwników naturalnych, w zależności od ich struktury, można
wydzielić kilka grup, np. barwniki: izoprenoidowe, porfirynowe, flawonoidowe,
betalainowe, chinoidowe i inne.
Przykładami barwnych związków naturalnych są karotenoidy. Karotenoidy należą do
barwników polienowych czyli mających sprzężony układ wiązań podwójnych. Są to
jednocześnie związki izoprenoidowe zbudowane z ośmiu jednostek izoprenowych
połączonych w ten sposób, że układ reszt izoprenowych jest odwrócony w środku
cząsteczki.
Karotenoidy obejmują karoteny  czterdziestowęglowe związki węglowodorowe oraz
ich pochodne zawierające grupy hydroksylowe, ketonowe a także modyfikowane w
inny sposób. Tlenowe pochodne karotenów to ksantofile. Karotenoidy występują
praktycznie we wszystkich roślinach i są kumulowane w organizmach wszystkich
zwierząt. Zidentyfikowano ponad 800 karotenoidów występujących w surowcach
naturalnych.
Sumaryczny wzór wszystkich karotenów jest taki sam - C40H56, są więc izomerami,
które różnią się liczbą pierścieni i liczbą podwójnych wiązań (jedno wiązanie
podwójne odpowiada zamknięciu jednego pierścienia).
W produktach naturalnych występuje mieszanina kilku do kilkudziesięciu
karotenoidów ale są też związki charakterystyczne (dominujące) dla danego
produktu. W marchwi takim dominującym związkiem jest �-karoten, w cząsteczce
którego występuje 11 wiązań podwójnych w układzie sprzężonym powodując, że
roztwór tego związku ma barwę żółtopomarańczową (krystaliczny jest
ciemnoczerwony lub brązowy) a maksima absorpcji w widmie UV-Vis występują przy
450 i 478 nm (w heksanie). �-Karoten jest najbardziej rozpowszechnionym
karotenoidem w produktach naturalnych.
2
�-karoten
Widmo UV-Vis �-karotenu
Dla pomidorów charakterystycznym karotenem jest likopen. Jest to
jaskrawoczerwony związek z niebieskawym odcieniem (max=443, 471 i 502 nm w
heksanie).
likopen
Widmo UV-Vis all-trans-likopenu (linia ciągła) i równowagowa mieszanina all-trans- i 13-cis-
likopenu (linia przerywana)
3
W owocach papryki występuje m.in. czerwony barwnik kapsantyna.
2.2. Chlorofile
Do najbardziej fundamentalnych barwników na Ziemi należą porfiryny. Podstawowy
szkielet cząsteczki stanowi układ 4 pierścieni pirolowych połączonych przez grupy
metinowe. Do barwników porfirynowych zaliczany jest chlorofil. Podstawowym
układem chromoforowym chlorofili a i b jest chloryna. Jest to porfiryna, w której
zewnętrzne wiązanie jednego z pierścieni jest uwodornione. Dla chlorofilu
charakterystyczne jest występowanie dwóch grup karboksylowych, z których jedna
jest zestryfikowana dwudziestowęglowym alkoholem terpenowym  fitolem, a druga
metanolem. Niebieskozielony chlorofil a przy C-3 ma grupę metylową a żółtozielony
b grupę formylową. W widmie UV-Vis charakterystyczne pasma absorpcji występują:
dla chlorofilu a przy 428 i 661 nm a dla chlorofilu b przy 453 i 642 nm (w eterze
dietylowym).
Chlorofile są związkami mało trwałymi, mogą ulegać szeregu przemianom. W
wyższych temperaturach, szczególnie w środowisku kwaśnym,  tracą jon Mg2+.
Powstają oliwkowobrunatne feofityny a i b. Dodatkowo zachodzi hydroliza wiązań
estrowych. Natomiast w środowisku zasadowym zachodzi hydroliza wiązań
estrowych bez usuwania Mg2+. Powstające chlorofiliny zachowują barwę zieloną, a
ich sole (Na+, K+) są dobrze rozpuszczalne w wodzie. Charakterystyczną
właściwością chlorofilu jest możliwość wymiany jonów Mg2+ na jony innych metali.
Wymiana Mg(II) na Cu(II) lub Zn(II) powoduje zwiększenie stabilności zielonej barwy
chlorofilu.
Chlorofil jest podstawowym barwnikiem chloroplastów ale obok niego występują inne
barwniki, m.in. z grupy karotenoidów: karoteny i ksantofile (tlenowe pochodne
karotenów, np. luteina, wiolaksantyna czy neoksantyna).
4
Chlorofil a
Widma UV-Vis chlorofili: �� chlorofil a, ----- chlorofil b
5
2.3. Chromatografia kolumnowa
Chromatografia kolumnowa polega na rozdzielaniu mieszanin substancji
chemicznych poprzez wprowadzenie ich na stałą fazę stacjonarną (adsorbent)
umieszczoną w cylindrycznej kolumnie i rozdzieleniu jej na poszczególne składniki
przy użyciu ciekłej fazy ruchomej. Typowa kolumna chromatograficzna to rurka
szklana o stosunku średnicy do długości od ok. 1 : 15 do 1 : 60.
W kolumnie umieszcza się adsorbent. W chemii organicznej najczęściej stosowany
jest żel krzemionkowy (adsorbent silnie polarny). Na szczyt kolumny nanosi się
mieszaninę związków. Przez kolumnę przepuszcza się odpowiedni rozpuszczalnik
(zwany eluentem) lub mieszaninę rozpuszczalników i w wyniku istnienia różnic w sile
oddziaływań międzycząsteczkowych dla różnych związków pomiędzy składnikami
mieszaniny a fazą ruchomą oraz składnikami mieszaniny a fazą stacjonarną
następuje jej rozdzielenie na indywidualne substancje.
Związki polarne adsorbują się silniej na polarnych cząsteczkach żelu
krzemionkowego, dlatego gdy zastosujemy rozpuszczalnik mało polarny, będą
wymywane z kolumny póz
niej niż składniki mniej polarne.
Odpowiedni dobór rozpuszczalników ułatwia znajomość tak zwanego szeregu
eluotropowego, który polega na uszeregowaniu eluentów według wzrastającej mocy
elucyjnej (zależnej od stałej dielektrycznej rozpuszczalnika). Dla polarnych faz
stacjonarnych kolejność ta przedstawia się następująco:
n-pentan < n-heksan < cykloheksan < tetrachlorek węgla < toluen < chloroform
< dichlorometan < eter dietylowy < octan etylu < aceton < etanol < metanol
Napełnianie kolumny
Sposób napełniania kolumny ma decydujący wpływ na poprawne rozdzielanie
substancji z użyciem chromatografii kolumnowej.
��Suchą kolumnę umieścić na statywie w pozycji pionowej. Przy wylocie kolumny
umieścić zlewkę lub kolbę stożkową do odbierania eluentu.
��Do zlewki wlać eluent i wsypać adsorbent.
��Zamieszać zawiesinę i zanim opadnie na dno, przelać do kolumny (napełnić
zawiesiną około 2/3 wysokości kolumny).
6
��Odczekać chwilę do  ubicia się adsorbentu w kolumnie (ew. lekko postukać
wężykiem z PCW). W czasie napełniania kranik powinien być lekko otwarty.
�� Spuścić eluent, aż do momentu gdy wysokość eluentu nad adsorbentem wyniesie
ok. 5 mm.
��Zamknąć kran.
Aplikacja próbki na kolumnę
��Próbka rozpuścić w możliwie jak najmniejszej ilości eluentu.
��Ostrożnie wprowadzić ją na warstwę adsorbentu.
��Następnie należy ostrożnie dodać eluent, tak by nie dopuścić do zmieszania się z
rozdzielaną próbką.
Rozwijanie kolumny i zbieranie frakcji
��Ostrożnie otworzyć kran.
��Dolewać rozpuszczalnik starając się utrzymywać stałą jego wysokość nad fazą
stacjonarną.
��Od dołu kolumny odbierać kolejne frakcje w kolbki stożkowe.
��Proces prowadzić do czasu aż wszystkie analizowane związki opuszczą kolumnę.
Należy zapamiętać, że nie należy dopuścić do obniżenia się poziomu
rozpuszczalnika poniżej poziomu adsorbentu!
2.4. Chromatografia cienkowarstwowa
Rozdzielanie substancji może być zrealizowane również wtedy, gdy faza stacjonarna
jest w postaci cienkiej warstwy naniesionej na powierzchnię szkła, folii aluminiowej
lub z tworzywa sztucznego. Tak realizowaną chromatografię nazywa się
chromatografią cienkowarstwową (Thin Layer Chromatography  TLC) lub planarną. I
tu najczęściej stosowanym adsorbentem jest żel krzemionkowy. Zalety TLC to
prostota wykonania rozdzielania, niski koszt wyposażenia i wykonania, duża czułość,
duża szybkość rozwijania chromatogramów, możliwość kontrolowania stopnia
rozdzielenia substancji na każdym jego etapie, możliwość przechowywania płytek z
rozdzielonymi substancjami czy też możliwość zastosowania różnych metod detekcji.
Substancje wzorcowe oraz analizowaną mieszaninę nanosi się na płytkę
dopasowaną wielkością do wielkości komory chromatograficznej oraz ilości
analizowanych substancji, np. o wymiarach 4x8 cm, punktowo (za pomocą kapilary,
plamki powinny być jak najmniejsze), na linię startu zaznaczoną ołówkiem w
7
odległości 0,8-1,0 cm od dolnej krawędzi płytki. Między punktami nanoszenia
poszczególnych substancji powinna być zachowana odległość 1 cm. Skrajne plamy
startowe powinny znajdować się w odległości nie mniejszej niż 1 cm od brzegu płytki.
W przypadku rozcieńczonych roztworów nakłada się je kilkakrotnie w to samo
miejsce (susząc płytkę po każdej takiej operacji). Następnie płytkę wstawia się do
wcześniej przygotowanej komory chromatograficznej, w której znajduje się 0,5 cm
warstwa eluentu. Komora powinna być wysycona parami eluentu (tj. pozostawiona z
eluentem na kilka minut, korzystne jest również wyłożenie komory płatkiem bibuły, co
ułatwia wysycenie komory parami rozpuszczalników).
Chromatogram rozwija się poprzez wędrówkę cieczy w górę płytki, na skutek
działania sił kapilarnych. Gdy czoło eluentu osiągnie linię mety (ok. 1 cm od górnej
krawędzi płytki) chromatogram wyjmuje się z komory i suszy. Jeśli badane
substancje nie są barwne, należy chromatogram wywołać np. za pomocą
odpowiedniego odczynnika (powszechnie stosowane jest wywoływanie
chromatogramu w parach jodu). Dogodną metodą detekcji jest światło UV. Stosuje
się wówczas żel zawierający fluoryzujące dodatki.
Cechą każdej substancji identyfikowanej metodą TLC, w określonym układzie
chromatograficznym (adsorbent i faza ruchoma) jest tzw. współczynnik Rf (ang.
retardation factor), wyznaczany jako stosunek dróg przebytych jednocześnie przez
środek strefy migrującej substancji i czoło eluentu:
dystans przebyty przez srodek plamki
a
Rf =
=
b
dystans przebyty przez czolo fazy ruchomej
Sposób obliczania współczynnika Rf z chromatogramu
Porównanie wartości Rf substancji badanej i wzorca w kilku układach
chromatograficznych (przynajmniej trzech) stanowi podstawę do jej identyfikacji.
8
2.5. Literatura
1. H.T.Quach, R.L. Steeper, G. W. Griffin, J. Chem. Educ. 81, 3 (2004)
2. Ćwiczenia laboratoryjne z chemii bioorganicznej, Wyd. Uniwersytetu
Opolskiego, P. Kafarski, P. Wieczorek, Opole 1997
3. http://www.chem.uw.edu.pl/zcho/IIIrok/IZO/izolabB.pdf
4. Ćwiczenia z biochemii, L. Kłyszejko-Stefanowicz; Wydawnictwo Naukowe
PWN, Warszawa 1999
5. Chemia ogólna, Ćwiczenia Laboratoryjne, red. E. Luboch, M. Bocheńska,
J.F. Biernat, Wyd. PG, Gdańsk 2003
Zagadnienia, na które należy zwrócić szczególną uwagę przygotowując się do
zaliczenia ćwiczenia to:
�� Budowa chemiczna takich barwnych związków naturalnych, jak: �-karoten, likopen i
w uproszczeniu chlorofil (układ porfirynowy). Jakie elementy struktury są
odpowiedzialne za barwność tych związków?
�� Chromatografia kolumnowa i szereg eluotropowy rozpuszczalników.
�� Technika chromatografii cienkowarstwowej, wyznaczanie współczynnika Rf.
3. Metodyka badawcza
W części praktycznej ćwiczenia studenci w największym stopniu będą wykorzystywali
techniki chromatograficzne (grawitacyjna, adsorpcyjna chromatografia kolumnowa,
chromatografia cienkowarstwowa a także nie opisana tutaj flash chromatography) a
także metody ekstrakcyjne, w celu wyizolowania z surowców naturalnych barwnych
substancji organicznych. Do zatężania i odparowywania roztworów wykorzystają
odparowywacz rotacyjny. Dodatkowo zarejestrowane zostaną widma UV-Vis
wyizolowanych i rozdzielonych substancji. W tym celu wykorzystany zostanie
spektrofotometr UNICAM UV300 series.
4. Wykonanie doświadczeń
4.1. Wydzielanie i rozdzielanie barwników z papryki
5 g suchej, sproszkowanej papryki miesza się, silnie wstrząsając, ze 100 ml chlorku
metylenu przez ok. 15 min. Po usunięciu nierozpuszczalnej pozostałości z przesączu
usuwa się rozpuszczalnik za pomocą rotatora i sporządza widmo UV-Vis mieszaniny
9
produktów barwnych. Mieszaninę tą analizuje się za pomocą chromatografii
cienkowarstwowej, używając płytek pokrytych żelem krzemionkowym. Chromatogram
dodatkowo wywołuje się parami jodu.
Rozdzielania mieszaniny dokonuje się za pomocą chromatografii kolumnowej. W tym
celu do kolumny wlewa się mieszaninę żelu krzemionkowego w chlorku metylenu. Po
przygotowaniu kolumny na jej szczyt nanosi się mieszaninę barwników papryki w 2
ml chlorku metylenu i prowadzi się elucję tym rozpuszczalnikiem. Zbiera się
poszczególne barwne frakcje i bada ich czystość za pomocą chromatografii
cienkowarstwowej i spektrofotometrii UV-Vis.
4.2. Wydzielanie i rozdzielanie barwników ze szpinaku
a). Próbkę rozmrożonego szpinaku należy dobrze odcisnąć między warstwami
bibuły. Odważyć 10 g odciśniętego szpinaku i umieścić go w moz
dzierzu. Dodać do
niego ok. 15 g bezwodnego siarczanu magnezu (w celu usunięcia reszty wody) i
ucierać ok. 10 minut aż do uzyskania pudrowej, gładkiej konsystencji szpinaku
(dokonujemy w ten sposób mechanicznej lizy komórek roślinnych, co ułatwi
ekstrakcję barwników). Po uzyskaniu jasnozielonej mieszaniny, zawartość
moz
dzierza należy przenieść do zlewki i dobrze rozmieszać z ok. 40 ml acetonu.
Odstawić na ok. 10 minut, aby osad mógł swobodnie opaść. Następnie należy
zdekantować warstwę acetonową do przygotowanej kolbki okrągłodennej (niewielką
ilość mieszaniny należy przenieść do fiolki i wykorzystywać tą próbkę do analizy
chromatograficznej TLC) i rozpuszczalnik odparować na rotatorze  do sucha w
możliwie niskiej temperaturze. Pozostałość rozpuścić w ok. 2 ml acetonu i nanieść na
szczyt kolumny chromatograficznej wypełnionej żelem krzemionkowym w eterze
naftowym. Kolumnę eluować eterem naftowym, który wymyje z niej karoteny (można
też zastosować mieszaninę eter naftowy- aceton 20:1).
10
Gdy eluat stanie się bezbarwny, należy wymienić odbieralnik i wyeluować chlorofile
za pomocą acetonu. Następnie należy zbadać skład poszczególnych frakcji
(mieszanina nanoszona na kolumnę, poszczególne frakcje z kolumny i wzorcowy �-
karoten) za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (obliczyć wartość Rf dla
poszczególnych barwnych plam) i poddać je analizie spektrofotometrycznej.
Przykładowy chromatogram początkowej mieszaniny, w układzie eter etylowy:
cykloheksan : octan etylu : aceton : metanol (60:16:10:10:4), pokazano poniżej:
Inne proponowane układy do rozdzielania:
- heksan : aceton 70 : 30
- i-oktan : aceton : eter naftowy 60 : 20 : 20
- cykloheksan : aceton : eter naftowy 50 : 25 : 25
Przykładowe, literaturowe wartości Rf barwników liści w układzie heksan:aceton (7:3)
Barwnik Barwa Wartość Rf
�-karoten żółto-pomarańczowy 0,91
Feofityna szary 0,75
chlorofil a niebiesko-zielony 0,63
chlorofil b zielony 0,58
ksantofile żółte 0,53; 0,47; 0,32
b). 10 g odciśniętych liści mrożonego szpinaku ucierać w moz
dzierzu
porcelanowym z 20 ml acetonu. Acetonową zawiesinę przesączyć. Operację
ucierania powtórzyć jeszcze dwukrotnie. Połączone ekstrakty acetonowe
przenieść do rozdzielacza i ekstrahować kilkakrotnie eterem naftowym.
Oddzielone frakcje eteru naftowego przenieść ponownie do rozdzielacza i
przemyć je dwukrotnie małymi porcjami wody. Oddzielić warstwę organiczną i
wysuszyć ją MgSO4 lub Na2SO4. Osuszony roztwór barwników zatężyć
11
odparowując rozpuszczalnik na rotatorze i nanieść go na kolumnę
chromatograficzną. Dalej postępować jak w punkcie a).
4.3. Otrzymywanie kompleksu feofityny z miedzią
Pocięte na paski liście ogrzewać w 10% roztworze kwasu octowego zawierającym
chlorek miedzi. Równolegle ogrzewać liście tylko w roztworze kwasu octowego
(próba kontrolna). Obserwować zmiany zachodzące w obu roztworach.
4.4. Rozdzielanie barwników zawartych w koncentracie
pomidorowym (likopen i �-karoten) metodą TLC
a). Ok. 10 g koncentratu pomidorowego umieścić w rozdzielaczu, do którego wlano
uprzednio ok. 50 ml chlorku metylenu. Wyekstrahować barwniki do fazy organicznej i
odebrać ją do kolbki okrągłodennej o pojemności 100 ml. Rozpuszczalnik odparować
na rotatorze. Do pozostałości dodać niewielką ilość chlorku metylenu i zanalizować
jej zawartość metodą TLC odnosząc dodatkowo na płytce wzorzec �-karotenu
(dobrać odpowiedni układ chromatograficzny).
b). Na płytkę do preparatywnej TLC o wielkości 20x20cm nałożyć pasmowo
uzyskany w punkcie a) roztwór i rozwijać w dużej komorze chromatograficznej w
dobranym w punkcie a) układzie. Po wysuszeniu płyty wyskrobać pasmo
wytypowane jako likopen i odmyć żel krzemionkowy chlorkiem metylenu. Roztwór
zanalizować wykonując TLC oraz widmo UV-Vis. Porównać uzyskane widmo z
widmem literaturowym.
5. Opracowanie wyników
W sprawozdaniu należy podać wzory strukturalne barwnych związków naturalnych,
które były przedmiotem wykonywanych ćwiczeń, opisać te ćwiczenia (łącznie z
zamieszczeniem schematycznych rysunków uzyskanych chromatogramów). Omówić
skuteczność rozdzielania barwników przy użyciu chromatografii kolumnowej na
podstawie wykonanej analizy TLC. Krótko omówić uzyskane widma UV-Vis (sczytać
maksima absorpcji i porównać widma z literaturowymi).
12