Charakterystyka DNA: oznaczanie stężenia, ciężaru cząsteczkowego i form
konformacyjnych DNA przez elektroforezę w żelu agarozowym.

Elektroforeza w żelach agarozowych i poliakrylamidowych jest techniką używaną do

rozdziału, oznaczania i oczyszczania kwasów nukleinowych i białek.
Rozdział polega na migracji rozdzielanych substancji pod wpływem przyłożonego prądu
elektrycznego. W obojętnym pH DNA ma ładunek ujemny i wędruje do anody.
Stosowane techniki różnią się od siebie zdolnością rozdzielczą i zakresem rozdziału.

Żele poliakrylamidowe są najbardziej efektywne, rozdzielają cząsteczki DNA o

wielkości od 5 do 500 pz, a w pewnych warunkach można rozdzielić fragmenty DNA
różniące się jednym nukleotydem. Można również rozdzielić dwa łańcuchy DNA o takiej
samej długości jeśli różnią się one sekwencją nukleotydów.

W żelach agarozowych można rozdzielić fragmenty od 200pz do 50000pz, ale ich

zdolność rozdzielcza jest niższa.

W elektroforezie w żelach agarozowych szybkość migracji liniowych cząstek DNA

jest odwrotnie proporcjonalna do log

10

z ilości par zasad. Duże cząsteczki migrują wolniej,

gdyż większa jest siła tarcia podczas migracji. Liniowe cząsteczki DNA zostają zorientowane
przez pole elektryczne i migrują równolegle do lini pola.
Na szybkość migracji fragmentów w żelu wpływa:



wielkość fragmentów DNA - mniejsze fragmenty wędrują szybciej



stężenie żelu:

-wzrost stężenia żelu obniża szybkość migracji

-wzrost stężenia żelu wpływa również na zakres rozdziału cząsteczek DNA

Stężenie żelu

Wielkość fragmentów efektywnie rozdzielanych

0,3%

5-60kpz

0,6%

1-20kpz

0,9%

0,5-7kpz

1,2%

0,4-6kpz

1,5%

0,2-3kpz

2%

0,1-2kpz



konformacja DNA

3 formy konformacyjne plazmidowego DNA, superspiralna kolista (CCC), otwarta

kolista (OC) i liniowa (L) wędrują przez żel z różną szybkością. Zwykle najszybciej wędruje
forma CCC, następnie forma L, a najwolniej forma OC. Czasami jednak w zależności od
stężenia żelu, wartości przyłożonego prądu i siły jonowej buforu forma liniowa wyprzedza
formę CCC. By określić który prążek jest cząsteczką DNA o formie CCC można
przeprowadzić doświadczenie polegające na elektroforezie próbki w żelach zawierających
różne stężenia bromku etydyny (EtBr). Bromek etydyny rozwija superspiralne skręty DNA i
powoduje, że forma CCC migruje wolniej.



napięcie prądu

Przy niskich napięciach szybkość migracji jest proporcjonalna do przyłożonego

napięcia. Jeśli napięcie wzrasta to szybkość migracji cząstek DNA wzrasta w zależności od
wielkości. Najlepsze rozdziały elektoforetyczne są otrzymywane przy zastosowaniu prądu ok.
5V/cm odległości pomiędzy elektrodami.

Żele agarozowe używane są zwykle do horyzontalnej elektroforezy zanurzeniowej

określanej jako "submarine electrophoresis", gdyż żel jest całkowicie zatopiony w buforze w
którym wykonywana jest elektroforeza.

Używane są trzy rodzaje buforów:



boranowy (Tris Borate Electrophoretic buffer - TBE)



octanowy (Tris Acetate Electrophoretic buffer - TAE)



fosforanowy (Tris Phosphate Electrophoretic buffer - TPE)

Bufory różnią się siłą jonową i pojemnością buforową. Najczęściej używany jest bufor

boranowy-TBE. Przygotowany 10x stężony roztwór wyjściowy jest rozcieńczany do roztworu
roboczego (1x) przed przygotowaniem żelu.

Przygotowanie żelu.

Żele agarozowe są przygotowywane na płytkach szklanych lub w tzw. rynienkach.

Przed wylaniem żelu na rynienkę należy zakleić plastrem jej boczne krawędzie lub umieścić
rynienkę w aparacie do wylewania żeli. Objętość przygotowanego żelu zależy od pojemności
płytki.

W celu przygotowania żelu należy do odważonej agarozy dodać odpowiednią

objętość buforu do elektroforezy np. TBE. Taką zawiesinę należy gotować do całkowitego
rozpuszczenia agarozy, a następnie ochłodzić do temperatury ok. 45



C. Żel wylać na

uprzednio przygotowaną płytkę szklaną lub rynienkę i ustawić grzebień. Grzebień powinien
być ustawiony równolegle do krawędzi żelu, a jego zęby powinny się znajdować w
odległości ok. 0,5-1 mm od dolnej powierzchni. Żel krzepnie ok. 20 min. w zależności od
temperatury otoczenia. Żele zawierające mniej niż 0,7% agarozy są przygotowywane w
chłodni w temperaturze 4



C. Po zastygnięciu żelu należy ostrożnie wyjąć grzebień

przytrzymując delikatnie powierzchnię żelu. Przygotowany żel należy umieścić w aparacie do
elektroforezy i zalać buforem 1 x TBE.

Przygotowanie próbek DNA.

Do sprawdzenia ilości wyizolowanego DNA używany jest zwykle 1



l roztworu DNA.

Dla zwiększenia objętości i ograniczenia strat przy nakładaniu do próbki dodajemy 4



l buforu

TC lub wody. Do tak przygotowanej próbki dodajemy 1



l 6x stężonego buforu

obciążającego. Bufor obciążający służy do zagęszczenia próbki DNA tak by umożliwić jej
nałożenie do studzienki w żelu. Bufor obciążający zawiera jeden lub dwa barwniki do
elektroforezy tj. ksylen cyjanol (0,25%) i błękit bromofenolowy (0,25%) oraz 40% sacharozę
lub 30% glicerol. Barwniki elektroforetyczne mirują w żelu razem z cząsteczkami DNA.

Błękit bromofenolowy migruje ok. 2,2 razy szybciej niż ksylen cyjanol. Szybkość migracji
błękitu bromofenolowego odpowiada szybkości migracji liniowej cząsteczki dsDNA
(dwuniciowe DNA) o wielkości 300pz, podczas gdy ksylen cyjanol migruje z szybkością
równą fragmentom dsDNA o wielkości 4000pz.

Po nałożeniu próbek na żel i podłączeniu do zasilacza ustawiamy napięcie na ok. 120-

140V. Elektroforezę prowadzimy do momentu, gdy błękit bromofenolowy osiągnie 3/4
długości żelu. Po odłączeniu napięcia żel przenosimy do naczynia zawierającego roztwór
bromku etydyny. Bromek etydyny jest silnym mutagenem, dlatego czynności te należy
wykonywać w rękawiczkach.

Bromek etydyny

Bromek etydyny jako barwnik akrydynowy wnika pomiędzy nici DNA specyficznie

wybarwiając żel. Po oświetleniu żelu lampą UV 260 nm DNA świeci na czerwono. Również
niezwiązany z DNA bromek świeci na czerwono. Dla odpłukania niespecyficznie związanego
z żelem bromku, żel zostawiamy na kilka godzin w wodzie destylowanej. Czasami bromek
etydyny jest dodawany bezpośrednio do żelu. W czasie elektroforezy bromek wędruje w
przeciwnym kierunku niż DNA i jest usuwany z żelu wybarwiając specyficznie DNA.

Elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym

W elektroforezie w żelu agarozowym można rozdzielić efektywnie fragmenty DNA o

wielkości do kilkudziesięciu tysięcy par zasad. Rozdziały takie można uzyskać w
niskoprocentowych żelach (0,2%-0,35%), ale takie żele są bardzo nietrwałe i wymagają
specjalnej obróbki. Rozdział dużych fragmentów rzędu kilkuset kpz uzyskuje się przez
elektroforezę w zmiennym polu elektrycznym. Duże cząsteczki DNA są uwięzione w żelu i
przy zmianie biegunów pola elektrycznego duże fragmenty wymagają dłuższego czasu na
zmianę orientacji podczas, gdy krótsze fragmenty szybciej zmieniają orientację i szybciej
migrują. W oryginalnie opisanej metodzie uzyskano rozdziały fragmentów o wielkości 2Mpz
(mega par zasad), a dalsze usprawnienia metody umożliwiają rozdział 5Mpz DNA.