polimery 2 id 371544 Nieznany

background image

Ćwiczenia laboratoryjne z przedmiotu „Biopolimery” dla

makrokierunku Bioinformatyka

Przygotował: mgr Michał Dobkowski

I. Wyodrębnianie RNA z drożdży. Elektroforeza agarozowa kwasów

nukleinowych.

RNA obecne w drożdżach można wyekstrahować ze zhomogenizowanych komórek za

pomocą 2% roztworu soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS). Tak otrzymany ekstrakt zawiera
niewielkie ilości DNA (<0,5%) i białka (<2,0%). Charakterystykę jakościową otrzymanego RNA
można wykonać przy pomocy elektroforezy żelowej.

Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:

Świeże drożdże

2% roztwór SDS (soli sodowej siarczanu dodecylu)

95% etanol

Roztwór octanu potasu (200 g/

L

, pH 5,0)

Bufor TBE (Tris/kwas borowy/EDTA) – roztwór podstawowy 10-krotnie stężony o składzie:

108 g Tris, 55 g kwasu borowego oraz 3,7 g EDTA w 1000 m

L

wodnego roztworu

Bufor ładujący: 50% roztwór gliceryny w buforze TBE z dodatkiem błękitu

bromofenylowego

Wirówka

Łaźnia wodna

Kolby płaskodenne i okrągłodenne

Cylindry miarowe

Zlewki

Agaroza

Bromek etydyny

Aparat do elektroforezy agarozowej

Transluminator lub zwykła lampa UV

Wykonanie ćwiczenia
1. Izolacja RNA

W kolbie płaskodennej doprowadzić do wrzenia 10 m

L

2% roztworu SDS. Do wrzącego

roztworu dodać 2 g rozdrobnionych świeżych drożdży, zawartość ogrzewać przez 3 minuty.

Kolbę schłodzić strumieniem zimnej wody z kranu, przenieść jej zawartość do probówki

wirówkowej i odwirować przez 10 min przy 6000 RPM.

background image

Supernatant przenieść do kolbki płaskodennej, dodać 1 m

L

roztworu octanu potasu

oraz 22 m

L

etanolu.

Mieszaninę z wytrąconym RNA wsadzić do zamrażalnika na 0,5 godziny, a następnie

odwirować przez 6 min przy 6000 RPM.

Roztwór znad osadu zdekantować, zaś otrzymany osad RNA rozpuścić w 1 m

L

wody.

!!!

Roztwory otrzymane w wyniku izolacji RNA z drożdży należy przechowywać w temperaturze

0°C, aż do momentu ich analizy.

2. Przygotowanie żelu

Przygotować 2

L

rozcieńczonego buforu TBE biorąc 1 część stężonego roztworu i 9 części

wody.

Następnie naważyć 0,8 g agarozy i dodać ją do 100 m

L

uprzednio przygotowanego buforu

w kolbie płaskodennej. Całość doprowadzić do wrzenia i odczekać, aż cały roztwór będzie
klarowny.

Odczekać 2-3 minuty a następnie dodać 5 μ

L

bromku etydyny

*

. Po rozpuszczeniu bromku

etydyny całość starannie wymieszać.

* Ostrożnie, substancja kancerogenna, należy pracować tylko w rękawiczkach!

Zmontować pod wyciągiem zestaw do wylewania żelu agarozowego i do poprawnie

zamontowanego zestawu (uwaga: sprawdzić szczelność!) wylać roztwór agarozy. Należy
pamiętać, aby w zestawie znajdował się grzebień do tworzenia studzienek w żelu.

Po 20 minutach żel przenieść do aparatu do elektroforezy agarozowej, zalać uprzednio

przygotowanym rozcieńczonym buforem TBE i ostrożnie wyjąć grzebień z żelu.

3. Nanoszenie próbki na żel

W probówkach Eppendorfa umieścić kolejno 20, 40, 60 i 100 μ

L

otrzymanego w wyniku

izolacji roztworu RNA i do każdej z nich dodać odpowiednio takie same objętości buforu
ładującego.

Zachowując ostrożność delikatnie nanieść próbkę do studzienki za pomocą pipety

automatycznej.

Należy pamiętać o tym, że podczas pracy z RNA lub DNA, trzeba pracować w rękawiczkach
jednorazowych, a szkło powinno być czyste (najlepiej przemyte bezpośrednio przed użyciem
etanolem i wysuszone).


Zakres materiału: budowa i funkcje kwasów nukleinowych, metoda elektroforezy żelowej

Literatura:
Stryer L. Biochemia; PWN
Kłyszejko-Stefanowicz L. Ćwiczenia z Biochemii, PWN, 1999
Murray R. K. Biochemia Harpera; PZWL

background image

II. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradforda

Białka należą do podstawowych biopolimerów wchodzących w skład komórki. Zmiany

stężenia białek kontrolują procesy metaboliczne komórki. Ponadto oznaczenie stężenia białka
umożliwia określenie wartości energetycznej spożywczych produktów białkowych.

Do określenia stężenia białka używana jest metoda Melanii M. Bradford. Wykorzystuje

zjawisko tworzenia się kompleksu pomiędzy barwnikiem (Coomassie Brilliant Blue) a białkami.
(Cząsteczka barwnika CBB oddziałuje poprzez grupy -SO

-3

z dodatnio naładowanymi resztami

aminokwasowymi). Kompleks białko-barwnik powoduje przesunięcie długości fali odpowiadającej
maksimum absorpcji barwnika CBB* z 465 nm do 595 nm. Wartość absorbancji jest proporcjonalna
do stężenia białka. Jako wzorzec białka stosuje się albuminę bydlęcą. Liniowa zależność absorbancji
od stężenia leży w zakresie stężenia białka 0,1-1,4 mg/ml

*Błękit brylantowy Coomassie G-250 w środowisku kwaśnym ma brunatne zabarwienie, które po reakcji z
białkiem zmienia się na błękitne. Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze.


Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:

Próbki białka o nieznanym stężeniu (np. mleko)

Roztwór wzorcowy białka o stężeniu 1 mg/m

L

Odczynnik Bradford

1% roztwór kwasu octowego

Probówki zwykłe szklane oraz wirówkowe

Pipety miarowe automatyczne: 20-200 µl oraz 200-3000 µl

Wirówka

Kuwety pomiarowe plastikowe

Spektrofotometr UV-Vis



Wykonanie ćwiczenia
1. Przygotowanie próbki białka do pomiarów

Do probówki wirówkowej z 10 m

L

lekko ogrzanego mleka dodać powoli, mieszając, 4 m

L

1% kwasu octowego.

Wytrącony osad kazeiny odwirować przy 5000 RPM przez 5 min.

Supernatant wykorzystać do ilościowego oznaczenia sumarycznej zawartości globulin

i albumin w mleku.

Roztwór wzorcowy białka o znanym stężeniu początkowym (1 mg/m

L

) rozcieńczyć wodą

destylowaną w taki sposób, aby otrzymać po 0,1 m

L

rozcieńczonych roztworów wzorca

o stężeniach pokazanych w tabeli poniżej.




background image

Nr probówki

Objętość odczynnika

Bradford [mL]

Objętość roztworu białka

[m

L

]

Stężenie roztworu

białka [mg/mL]

1

2

0,1 (woda destylowana)

0

2

2

0,1 (roztwór wzorca)

0,25

3

2

0,1 (roztwór wzorca)

0,50

4

2

0,1 (roztwór wzorca)

0,75

5

2

0,1 (roztwór wzorca)

1,00

6

2

0,1

(nieznana próbka)

X


W 6 suchych probówkach umieścić po 2 m

L

odczynnika Bradford i jak najszybciej dodać po

0,1 m

L

roztworu białka zgodnie z opisem w tabeli powyżej. Delikatnie wymieszać zawartość

każdej probówki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min.

Po inkubacji, przy pomocy spektrofotometru UV-Vis, zmierzyć w kuwecie plastikowej

absorbancję próbek przy λ=595 nm. Kompleks białko-barwnik jest trwały przez 60 minut.
Absorbancja poszczególnych próbek powinna być zmierzona w jak najkrótszych odstępach
czasu. Kuwety między pomiarami można płukać metanolem. Kuwety myje się zanurzając je
na kilka godzin w 0,1 M roztworze HCl.


2. Opracowanie wyników

Na podstawie uzyskanych wyników, wykreślić krzywą wzorcową. Od wartości absorbancji

dla każdej próbki należy odjąć wartość absorbancji probówki nr 1 (tylko odczynnik
Bradford).

Z krzywej odczytać stężenie białka w nieznanej próbce (probówka nr 6). Określić

sumaryczną zawartość globulin i albumin w mleku.




Zakres materiału: Metody oznaczania stężenia białek, budowa I-IV rzędowa i funkcje białek,

wiązanie peptydowe.








Literatura:
Stryer L. Biochemia; PWN
Kłyszejko-Stefanowicz L. Ćwiczenia z Biochemii, PWN, 1999
Murray R. K. Biochemia Harpera; PZWL
Jakubke H., Jeschkeit H. Aminokwasy, peptydy, białka; PWN

background image

III. Synteza dipeptydu

Synteza peptydów metodą klasyczną, inaczej zwana syntezą w roztworze, jest dużo bardziej

praco- i czasochłonna od metody syntezy na nośniku stałym. Jednak w niektórych sytuacjach, jak
łączenie ze sobą długich polipeptydów, jest w dalszym ciągu powszechnie stosowana.
Obecność reaktywnych grup funkcyjnych w aminokwasach powoduje konieczność ich blokowania
w trakcie syntezy. Do syntezy wiązania peptydowego stosowane są związki chemiczne powodujące
kondensację grupy aminowej i karboksylowej, takie jak dicykloheksylokarbodiimid (DCC). Zwykle
najtrudniejszym i najbardziej czasochłonnym elementem każdego etapu syntezy jest proces
oczyszczania zsyntezowanego peptydu.

Stosowane skróty:
ACN - acetonitryl
Boc – t-butyloksykarbonyl
DCC – N,N’-dicykloheksylokarbodiimid
DCM – dichlorometan
DIC − N,N’-diizopropylokarbodiimid
DMF - dimetyloformamid
TEA – trietyloamina
HCl*Gly-OMe – chlorowodorek estru metylowego glicyny

Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:

HCl*Gly-OMe

0,4 mmola (M.cz. = 125,6)

Boc-Leu-OH

0,4 mmola (M.cz. = 231,3)

DCC

0,4 mmola (M.cz. = 206,3)

DCM

10 m

L

TEA

0,4 mmola (M.cz. = 101,19; d = 0,726 g/m

L

)

octan etylu

80 ml

5% HCl

40 ml

NaHCO

3(nas.)

40 ml

CaSO

4

(bezwodny)

acetonitryl

ninhydryna

kolba okrągłodenna 50 ml z korkiem

kolba okragłodenna 250 ml z korkiem

kolba płaskodenna 250ml z korkiem

rozdzielacz 250 ml

sączki bibułowe

płytki TLC bez indykatora fluorescencyjnego

lejki szklane x 4

mieszadło magnetyczne

myszki do mieszania

cylinder miarowy 250 ml

background image

Wykonanie ćwiczenia
1. Przygotowanie odczynników i szkła laboratoryjnego:

Aminokwasy rozpuścić osobno w 2-3 m

L

DCM w kolbkach stożkowych. Jeżeli występują

trudności w rozpuszczeniu dodać kilka kropel DMF.


2. Synteza peptydu.

Do kolby okrągłodennej o obojętości 50 m

L

dodać w kolejności:

10 m

L

DCM

0,4 mmola roztworu HCl*Gly-OMe

0,4 mmola TEA

0,4 mmola roztworu Boc-Leu

0,4 mmola roztworu DCC

Kolbę zamknąć korkiem.

Mieszaninę mieszać na mieszadle magnetycznym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej

(wykonać analizę TLC zgodnie z zaleceniami w p. 3 instrukcji).

Po 2 godzinach mieszaninę reakcyjną rozcieńczyć 80 m

L

octanu etylu.

Wytrącony osad dicykloheksylomocznika odsączyć na sączku bibułowym. Warstwę

organiczną (przesącz) przemyć: 5% HCl oraz nasyconym roztworem NaHCO

3.

Wysuszyć

nad CaSO

4.

Po usunięciu środka suszącego oddestylować rozpuszczalnik na wyparce próżniowej.

Pozostałość rozpuścić w 1 m

L

ACN.

Przy pomocy spektrofotometru wykonać analizę spektrofotometryczną tego roztworu

w zakresie 200-250 nm. Zidentyfikować pasmo wiązania peptydowego.


3. Kontrola przebiegu syntezy dipeptydu.

Przeprowadzić analizę TLC mieszaniny reakcji po czasie: 0, 30, 60, 120 min od rozpoczęcia

reakcji w układzie rozwijającym: octan etylu.


Na każdą płytkę chromatograficzną nanosimy wzorce stosowanych do syntezy aminokwasów!


Zakres materiału: właściwości fizykochemiczne aminokwasów, wiązanie peptydowe, budowa
peptydów, synteza peptydów: metodą klasyczną w roztworze i na nośniku stałym, chromatografia
cienkowarstwowa (TLC)


Literatura:
Kłyszejko-Stefanowicz L. Ćwiczenia z Biochemii, PWN, 1999
Stryer L. Biochemia; PWN
Murray R. K. Biochemia Harpera; PZWL
Jakubke H., Jeschkeit H. Aminokwasy, peptydy, białka; PWN

background image

Złożono dnia:

……………………………………………..

Zatwierdzono dnia: ……………………………………………..

Zatwierdził

……………………………………………..


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
B2 016 lepkospr polimery id 755 Nieznany (2)
29 Wytwarzanie polimerow id 322 Nieznany (2)
BETONY POLIMEROWE id 83106 Nieznany
Nanokompozyty polimerowe id 313 Nieznany
B2 016 lepkospr polimery id 755 Nieznany (2)
Kompozyty ceramika polimer id 2 Nieznany
polimery artykul WUM id 371549 Nieznany
polimery teoria id 371571 Nieznany
Chemia polimerow II id 113148 Nieznany
polimery imprintowane id 371558 Nieznany
B2 016 lepkospr polimery 3 id 7 Nieznany (2)
Kompozyty ceramika polimer id 2 Nieznany
Abolicja podatkowa id 50334 Nieznany (2)
4 LIDER MENEDZER id 37733 Nieznany (2)
katechezy MB id 233498 Nieznany
metro sciaga id 296943 Nieznany
perf id 354744 Nieznany
interbase id 92028 Nieznany
Mbaku id 289860 Nieznany

więcej podobnych podstron