Metody badania lekowrażliwości

drobnoustrojów.

Zasady antybiotykoterapii.

Katedra i Zakład Mikrobiologii CM UMK

Antybiotyki

– substancje chemiczne wytwarzane przez żywe

drobnoustroje (naturalne metabolity bakterii lub

grzybów),

otrzymywane syntetycznie (odtworzenie struktury naturalnego
wzorca) lub

półsyntetycznie (pochodna naturalnego produktu

uzyskana droga modyfikacji chemicznej)

mające zdolność

hamowania wzrostu i zabijania

drobnoustrojów

Chemioterapeutyk

–

substancja

o

aktywności

przeciwdrobnoustrojowej, uzyskana na drodze chemicznej, nie

posiadająca naturalnego wzorca w przyrodzie (np. sulfonamidy,
chinolony, nitrofurany, nitroimidazole)

Inokulum

– liczba komórek bakteryjnych w jednostce objętości

zawiesiny

wyrażana liczbą jednostek tworzących kolonie na

mililitr (jtk/ml lub CFU/ml).

Może być również określana w

jednostkach

zmętnienia lub gęstości optycznej

Podstawowe definicje

Efekt inokulum

– oznacza zjawisko zmiany kategorii wrażliwości

drobnoustroju w

zależności od wielkości inokulum

MIC

:

(ang. minimal inhibitory concentration)

określa najmniejsze

stężenie leku, wyrażone w mg/l, określone w warunkach in vitro,
hamujące wzrost bakterii przy określonej gęstości inokulum i w
określonym czasie

MBC

:

(ang. minimal bacteriocidal concentration) najmniejsze

stężenie

bakteriobójcze: określa minimalne stężenie leku wyrażone w mg/l,
określone w warunkach in vitro, przy którym ginie 99,9% komórek
bakteryjnych, przy

określonej gęstości inokulum i w określonym czasie

Podstawowe definicje c.d.

Antybiogram

–wzór wrażliwości badanego szczepu na wybrane

antybiotyki in vitro, wynik

każdej oceny lekowrażliwości

drobnoustrojów to antybiogram

Antybiogram podstawowy zawiera antybiotyki stosowane jako leki

pierwszego rzutu

Antybiogram rozszerzony zawiera

rozszerzoną listę antybiotyków

stosowanych

wobec

drobnoustrojów wielolekoopornych i/lub

izolowanych z

ciężkich zakażeń

Podstawowe definicje c.d.

Oporność kliniczna→sukces terapeutyczny jest niemożliwy do
osiągnięcia, pomimo zastosowania maksymalnych dawek leku

Oporność krzyżowa→niewrażliwość na wszystkie leki z danej grupy
chemicznej, lub czasem niespokrewnionych grup, gdy punkty uchwytu

dla

antybiotyków znajdują się blisko siebie

Oporność naturalna→stała cecha danego gatunku

Oporność nabyta→nowa cecha szczepu wynikająca ze zmian
materiału genetycznego

Podstawowe definicje c.d.

Wybiórcza toksyczność (szkodliwy dla drobnoustrojów
chorobotwórczych, nieszkodliwy dla gospodarza)

Brak

działania alergizującego ani anafilaktycznego

Chemiczna

trwałość

Dobra

rozpuszczalność w wodzie, roztworach soli,

glukozy, soku

żołądkowym i jelitowym oraz w płynach

tkankowych

Pożądane cechy antybiotyku
/chemioterapeutyku

Pożądane cechy antybiotyku

/chemioterapeutyku c.d.

Penetracja do miejsca, w

którym toczy się zakażenie

Brak degradacji w organizmie pacjenta do

związków

toksycznych

Brak

wywoływania oporności bakterii na swoje

działanie

Brak

wiązania się z białkami krwi w stopniu

obniżającym jego skuteczność

Niska cena

Główne grupy antybiotyków

i

chemioterapeutyków

•

Beta-laktamy

•

Aminoglikozydy

•

Tetracykliny

•

Glicylcykliny

•

Makrolidy/ketolidy

•

Linkozamidy

•

Streptograminy

•

Oksazolidynony

•

Glikopeptydy

•

Chloramfenikol

•

Polimyksyny

•

Ansamycyny

•

Sulfonamidy

•

Nitromidazole

•

Nitrofurany

•

Chinolny/fluorochinolony

•

Kwas fusydowy

•

Fosfomycyna

•

Leki przeciwgrzybicze

•

Leki przeciwwirusowe

Podziały antybiotyków

Pochodzenie (naturalne, syntetyczne)

Mechanizm

działania i punkt uchwytu

Zakres

działania (wąskie/szerokie spektrum)

Efekt

działania (bakteriobójczy/bakteriostatyczny)

Antybiotyki

– zakres działania

• Wąskie spektrum

– ograniczone do jednej grupy lub rodzaju

drobnoustroju

• wankomycyna, aztreonam

• Szerokie spektrum

– bakterie Gram (+) i Gram (-), czasem także

beztlenowce

• cefalosporyny III generacji, karbapenemy,
• tetracykliny, aminoglikozydy

Antybiotyki

– sposób działania

• Bakteriostatyczny

– zahamowanie wzrostu

• chloramfenikol, linkozamidy, makrolidy,

tetracykliny)

• Bakteriobójczy

– Efekt zależny od czasu działania

•



-laktamy

– Efekt zależny od stężenia

• aminoglikozydy, chinolony

Efekt poantybiotykowy

• Zahamowanie wzrostu bakterii

krótkotrwale eksponowanych na
antybiotyk, utrzymujące się po jego
usunięciu ze środowiska

– aminoglikozydy – do 8h u bakterii Gram-ujemnych, do

~ 4h u bakterii Gram-dodatnich

– fluorochinolony

Miejsca docelowe działania antybiotyków i

chemioterapeutyków

synteza

ściany komórkowej

• wiązanie się z grupą D-alanylo-D-alaniny, co

uniemożliwia

włączanie

podjednostek

do

peptydoglikanu



glikopeptydy

• inhibicja enzymów (transpeptydazy – PBP penicillin

binding

protein,

odpowiadają

za

poprzeczne

usieciowanie

ściany; karboksypeptydzy regulują

syntezę peptydoglikanu) katalizujących sieciowanie
podjednostek





-laktamy

Miejsca docelowe działania...

• replikacja i utrzymanie struktury DNA (np.

topoizomerazy)



chinolony

• transkrypcja (podjednostka



polimerazy)



ryfamycyny (ryfampicyna)

• translacja (podjednostki rybosomu 30S i 50S)



makrolidy,linkozamidy, tetracykliny, aminoglikozydy

• funkcjonowanie

błon

komórkowych



polimyksyny (kolistyna), aminoglikozydy

• specyficzne zablokowanie niektórych szlaków

metabolicznych



kotrimoksazol

trimetoprim/sulfametoksazol)

– pośrednio wpływa

na

replikację i transkrypcję

Podstawowe zasady doboru leku

• Czy mamy do czynienia z zakażeniem?

• Jaki drobnoustrój może być czynnikiem etiologicznym

zakażenia?

• Czy będzie konieczne stosowanie leku

przeciwdrobnoustrojowego?

• Czy należy wykonać badanie mikrobiologiczne?

• Jaki lek przeciwdrobnoustrojowy wybrać?

Hryniewicz W., Meszaros J. Antybiotyki w profilaktyce i leczeniu zakażeń,

PZWL, 2001

Racjonalna antybiotykoterapia

• końcowy efekt leczenia powinien być sumą oceny

klinicznej

(ustąpienie objawów chorobowych)

i bakteriologicznej (eliminacja czynnika etiologicznego =

eradykacja)

• Podstawowe zasady doboru antybiotyku oparte na:

– współczesnej wiedzy: klinicznej, farmakologicznej,

epidemiologicznej, mikrobiologicznej

– uwzględnienie stanu odporności pacjenta

Racjonalna

antybiotykoterapia - kryteria

• Skuteczność

– zależy od aktywności leku wobec czynnika zakażającego,

farmakokinetyki

(stężenie w ognisku zakażenia), dawki

• Bezpieczeństwo
• Możliwie niski koszt leczenia

• Możliwie wygodne stosowanie

• Jak najmniejsze szerzenie oporności

Terapia empiryczna

• Kryterium doboru leku:

– udokumentowane doświadczenia kliniczne

wskazujące na skuteczność określonego leczenia w
zakażeniach rozpoznanych na podstawie obrazu
klinicznego

– wybór leku w zakażeniu o określonym umiejscowieniu

i powodowanym przez określone drobnoustroje wg
rekomendacji

– stan oporności drobnoustrojów na danym terenie

Terapia empiryczna

Możliwa do zastosowania:

• w ostrych często spotykanych zakażeniach o niezbyt

ciężkim przebiegu np.: ZUM

• jako leczenie początkowe przed otrzymaniem wyniku

badania mikrobiologicznego (w ciężkich zakażeniach)

np.: ZOMR

Terapia celowana

• Na podstawie wyniku badania mikrobiologicznego

(ustalenie etiologii i lekowrażliwości)

– pobranie materiału przed rozpoczęciem leczenia

empirycznego

– pobranie materiału adekwatnego do zakażenia

– właściwy transport

Terapia skojarzona - synergizm

• Stosowanie 2 (lub więcej) leków

przeciwdrobnoustrojowych wykazujących

synergizm działania (efekt „wzmocnienia”)

• Cel:

– poszerzenia zakresu działania

– uzyskanie efektu bakteriobójczego

Mechanizmy działania antybiotyków na

komórkę bakteryjną

Metody oznaczania

lekowrażliwości

Oznaczanie

lekowrażliwości

jest

jednym

z

najważniejszych

etapów

rutynowej

diagnostyki

mikrobiologicznej

zakażeń bakteryjnych.

Procedura

określania lekowrażliwości wymaga

stałej

kontroli

wg. wytycznych z zakresu: wykonania,

interpretacji oraz standaryzacji.

24

Od 1 kwietnia 2011 r. w Polsce obowiązują rekomendacje
Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania

Lekowrażliwości

www.eucast.org

•

metody

•

wartości graniczne (interpretacja)

•

kontrola jakości

www.korld.pl
Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Oznaczania
Lekowrażliwości Drobnoustrojów do 2011 r.

Metody oznaczania

lekowrażliwości

Metody

jakościowe →

wynik:

wrażliwy,

(

średniowrażliwy), oporny

• dyfuzyjno-krążkowa
• przeglądowa
• genetyczna

Metody

ilościowe →wynik: MIC

• seryjnych rozcieńczeń antybiotyku w podłożu

(płynnym lub stałym)

• paski nasączone antybiotykiem w gradiencie stężeń

25

Metoda

krążkowo-dyfuzyjna Kirby - Bauera

Dyfuzja antybiotyku zawartego w

krążku promieniście przez agar do

podłoża z wytworzeniem gradientu stężeń.

Wielkość strefy zahamowania wzrostu bakterii jest wprost
proporcjonalna do stopnia

wrażliwości bakterii na antybiotyk - im

większa jest strefa zahamowania, tym bakteria jest bardziej
wrażliwa.

Najczęściej używana metoda testowania lekowrażliwości: dobrze
wystandaryzowana, powtarzalna, relatywnie tania.

Metody jakościowe

Metoda krążkowo-dyfuzyjna c.d.

Zasada 15-15-15



posiew murawowy

, jałową wymazówką, z zawiesiny

jednej do kilku kolonii bakterii w NaCl

o gęstości 0,5

w skali MacFarlanda

, w ciągu 15 minut od wykonania



nałożenie krążków w ciągu 15 minut od posiewu,
jałową pęsetą lub dyspenserem



początek inkubacji w ciągu 15 minut od nałożenia
krążków

27

EUCAST 2012

28

EUCAST 2012

(MH)

(MH-F)

Medium for fastidious organisms:

Metoda krążkowo-dyfuzyjna
stosowane podłoża

Warunki inkubacji

29

EUCAST 2012

Metoda krążkowo-dyfuzyjna
warunki inkubacji

Metoda krążkowo-dyfuzyjna
odczyt i interpretacja

W zależności od wielkości strefy, bakterie określa się na
podstawie przyjętych standardów jako:

wrażliwe,
(średnio wrażliwe),
oporne.

Metody jakościowe

Metoda

przeglądowa→identyfikacja określonych fenotypów

(np.

metycylinooporności gronkowców)

P

odłoże stałe/płynne zawiera ściśle określone stężenie

wybranego antybiotyku

Na/do

podłoża posiewa się zawiesinę drobnoustrojów i

inkubuje

Interpretacja

→stwierdzenie

obecności/braku

wzrostu

drobnoustrojów→oporność/wrażliwość

Podłoża chromogenne

32

CHROMagar

MRSA

CHROMagar VRE

Metody genetyczne

Wykrywanie genów warunkujących oporność, np:



PCR (pojedynczy lub multiplex)



hybrydyzacja

np. gen mecA

u gronkowców, geny van u enterokoków

33

Systemy automatyczne

np. VITEK 2, BioMerieux

• zamknięte, szczelne karty, zawierające antybiotyki w

podłożu Mueller-Hintona

• metoda półilościowa
• manualne przygotowanie zawiesiny badanych szczepów
• napełnianie kart, inkubacja i odczyt odbywa się w

aparacie

• lekowrażliwość: 6-13 h
• wyniki badań są automatycznie przesyłane do bazy

danych oprogramowania

Zalety:

oszczędność czasu, ograniczenie kontaktu

personelu z materiałem

34

Metody ilościowe

• Pozwalają na ocenę wartości MIC.

• Są stosowane dwie techniki:

– Metoda seryjnych rozcieńczeń antybiotyku w podłożu stałym lub

płynnym (pozwala na ocenę MBC)

– Etest-metoda dyfuzyjna z użyciem pasków bibułowych

nasyconych antybiotykiem w gradiencie stężeń.

Oznaczanie MBC, MIC

Paski nasączone antybiotykiem w gradiencie

stężeń np.: Etesty

• Badanie jest oparte na

dyfuzji antybiotyku

zawartego w pasku w
gradiencie stężeń do
podłoża, na którym
wzrasta badany szczep.