•

CEL I ZAKRES BADAŃ

Celem doświadczenia było zapoznanie się z metodyką badań mikrobiologicznych przy
wykorzystaniu posiewu metodą płytkową Kocha (głębinową i powierzchniową).

•

METODYKA

1. Rozcieńczenie próbek

Do rozcieńczenia wykorzystujemy próbówki zawierające po 9 cm^3 jałowej wody buforowanej lub
płynu Ringera. Operacja ta polega na pobraniu jałową pipetą 1cm^3 pierwotnej próbki, dodaniu go
do jednej z próbówek i dokładnym wymieszaniu powstałego roztworu. Otrzymujemy w ten sposób
10-krotne rozcieńczenie próbki pierwotnej (10^-1). Aby uzyskać kolejne rozcieńczenia powtarzamy
powyższy schemat, jednak z tą różnicą, że do kolejnych probówek dodajemy po 1cm^3 probówki o
rozcieńczeniu o rząd niższym (pamiętając o wymieszaniu roztworu w próbówce tuż przed
pobraniem. Przygotowujemy rozcieńczenia 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5 i 10^-6.

2. Posiew na podłoże stałe metodą powierzchniową

Na powierzchnię zestalonego podłoża agarowego odżywczego zwykłego nakłada się jałową pipetą
0,1ml próbki o odpowiednim rozcieńczeniu, po czym dokładnie rozprowadza po powierzchni
pożywki za pomocą sterylnej głaszczki bakteriologicznej. Operację wyjałowienia wykonuje się za
pomocą palnika Bunsena.

3. Posiew na podłoże stałe metodą głębinową

Na dno jałowej płytki Petriego nakłada się za pomocą jałowej pipety 1ml roztworu o odpowiednim
rozcieńczeniu, po czym zalewa się ją podgrzaną do temperatury ok. 50oC pożywką stałą, następnie
delikatnymi okrężnymi ruchami szkiełka miesza się posianą próbkę z pożywką i odstawia się
próbki do zastygnięcia. Po zastygnięciu pożywki, płytki odwracamy do góry dnem. Zarówno
nakładanie materiału na szkiełko Petriego jak i wlewanie upłynnionej pożywki powinno być
wykonywane przy jak najmniejszym uchleniu wieczka szkieka.

Wszystkie operacje powinno się wykonywać z zachowaniem ostrożności dbając o to, by próbki nie
uległy zakażeniu. W tym celu należy zdezynfekować blat, posiewy wykonywać jak najbliżej
zapalonego palnika Bunsena, jak również opalać brzegi próbówek przy każdym pobraniu.

Szkiełka przetrzymywane są w termostacie w temperaturze 26oC przez okres 48 godzin.

Po przeprowadzeniu doświadczenia należy policzyć ilość kolonii w 1ml zawiesiny, co odpowiada
liczbie bakterii znajdującej się w danej objętości danego rozcieńczenia.

•

WYNIKI

GR

10^-3

10^-4

ŚREDNIA

10^-5

ŚREDNIA

10^-6

JTK/cm^3

głębinowy

nb

344

656

190

108

144

19

144*10^5

I

nb

110

120

115

11

nb

1,1*10^6

głębinowy

nb

408

388

89

72

80,5

6

7,4*10^6

II

nb

43

68

56

*

*

nb

nb

5,6*10^6

Rodzaj
posiewu

powierzchni
owy

powierzchni
owy

Legenda:
*- próbka zakażona
nb- nie badano
np- niepoliczalne

W doświadczeniu wykorzystaliśmy 3 rozcieńczenia. Do obliczenia ilości jednostek tworzących
kolonię wybieramy te rozcieńczenia, pomiędzy którymi występuje 10-krotna różnica w liczebności
kolonii, te próbki posiane zostały poprawnie.
Ilość jednostek tworzących kolonię obliczamy według schematu postępowania:

–

w przypadku posiewu głębinowego przyjmujemy wynik z rozcieńczenia niższego i
mnożymy przez odwrotność jego rzędu oraz 1, gdyż próbka użyta do powiewu miała
objętość 1ml, tj:

190+108

2

⋅

10

5

=

144⋅10

5

[JTK/ml]

- w przypadku posiewu powierzchniowego przyjmujemy wynik z rozcieńczenia niższego i

mnożymy przez odwrotność jego rzędu oraz 10, gdyż pobrana do badań próbka miała objętość
0,1ml, tj:

100+110

2

⋅

10

4

⋅

10=110⋅10

5

[JTK/ml]

•

WNIOSKI

Wyniki otrzymane w doświadczeniu są do siebie zbliżone, więc nie wskazują jednoznacznie na
wyższość jednej z użytych metod. Można stwierdzić, ze metoda użyta w badaniach
mikrobiologicznych powinna być dostosowana do organizmów znajdujących się w próbce. Dla
organizmów tlenowych korzystniejszy wzrost zachodzić może po posiewie powierzchniowym,
natomiast ogranizmy anaerofilne będą lepiej rozwijąć się po posiewie głębinowym, co
spowodowane jest niższym potencjałem redox w głębi pożywki. Aby zapewnić nim warunki
beztlenowe próbki umieścić można w anaerostacie lub pokryć powierzchnię pożywki płynną
wazeliną lub dodać do pożywki substancje redukujące.
W przypadku, zawartość próbki oddawanej do badań jest nieznana, należy użyć metody głębinowej.