INŻYNIERIA ŚRODOWISKA

Piotr Owczarczyk

Gr. 7 wtorek 8.15 - 10.00

Temat: Metodyka Badań mikrobiologicznych

Cel: Zapoznanie się z metodyka badań mikrobiologicznych

Zakres: Posiew zawiesiny bakterii na podłoże agarowe i płynne.

Sposób wykonania:

Jako materiał zaszczepiający podłoża hodowlane stosuje się próbki zagęszczone, nierozcieńczone (naturalne) lub rozcieńczone. Rozcieńczanie pró­bek wykonuje się w jałowej wodzie buforowanej lub płynie Ringera. W tym celu przygotowuje się odpowiednią ilość kolbek zawiera­jących po 90 cm³ jałowej wody buforowanej. Do pierwszej kolbki dodaje się jałową pipetą poj. 10 cm³ próbki i dokładnie miesza. 1 cm³ tak przygotowanego rozcieńczenia odpowiada objęto­ści 0,1 cm³ badanej próbki (rozcieńczenie 10^-1). Ko­lejne rozcieńczenie (10^-2) zawierajęce w każdym 1 cm³ 0,01 cm³ wyjściowej próbki uzyskuje się, przenosząc 10 cm³ rozcieńczenia 10^-1 do następnej kolbki zawierajęcej 90 cm³ wody buforowanej. Dalsze rozcieńczenia (10^-3, 10^-4 itd.) wykonuje się w sposób ana­logiczny zwracając szczególne uwagę na dokładne miesza­nie i zmianę pipet dla każdego rozcieńczenia. W rutynowych ba­daniach wody rozcieńczenia próbek wykonuje się zachowując stosu­nek próbki wyjściowej do wody rozcieńczającej jak 1:9. Przy prawidłowo wykonanych rozcieńczonych, po okresie inku­bacji powinny wystąpić 10 -krotne różnice w liczebności bakterii wyrosłych przy posiewie materiału z kolejnych rozcieńczeń.

Wykonywanie posiewów

Posiewy bakteriologiczne wykonuje się za pomocą: drucików zakończonych pętlą (oczka bakteriologiczne), pipet pastaurowskich i pipet z podziałką o objętości od 0,1 do 10,0 cm³. Pod­czas posiewów wyloty probówek oraz igły i oczka bakteriologiczne służące do przenoszenia materiału powinny być opalane w płomie­niu palnika.

Posiewy na podłoża płynne wykonuje się zanurzając pod powierzchnię cieczy oczko lub pipetę z materiałem zaszczepiającym. Posiewy na podłoża stałe wykonuje się w dwojaki spo­sób: metodą powierzchniową i głębinową.

- Metoda powierzchniowa posiewu polega na równomiernym rozpro­wadzeniu materiału zaszczepiającego na powierzchnię zestalonej pożywki w płytce Petriego lub w probówce (tzw. agar skośny). Materiał zaszczepiający nanosi się na pożywkę jałową pipetą w ilości 0,1 cm³, rozprowadzając go po powierzchni podłoża jałową szklaną bagietką. Posiewy na agarze skośnym wykonuje się igłą, robiąc rysę na po­wierzchni podłoża.

- Stosując głębinową metodę posiewu, na dno jałowych płytek Pe­triego wlewa się pipetą 1 cm³ materiału zaszczepiającego i zalewa ostudzoną pożywką stałą. Pożywkę wylewa się z kolbek (bezpośrednio po opaleniu brzegu kolbki w płomieniu palnika) na płytki, wprost na posiany materiał. Wieczko płytki podczas posiewu i zalewania agarem uchyla się możliwie jak najmniej. W celu właściwego rozprowadzenia zawiesiny bakteryjnej w pożywce zawar­tość płytki należy równomiernie wymieszać. Pożywka powinna być rozprowadzana po dnie płytki równe, cienką warstwą. Po zestaleniu podłoża płytki odwraca się do góry dnem i wstawia do termostatu (odwracanie płytek jest konieczne ze względu na wydzielanie przez agar wody kondensacyjnej, która w przeciwnym wypadku osiadałaby na powierzchni podłoża, powodując rozlewanie wyrosłych kolonii). Posiew głębinowy w probówce wykonuje się, nakłuwając słupek ze­stalonej pożywki igłą bakteriologiczną z badanym materiałem. Wszystkie posiewy należy wykonywać, w co najmniej dwóch rów­noległych powtórzeniach.

Wyniki:

	10^-3	10^-4	10^-5
Posiew powierzchniowy	NP.	NP.	NP.
Posiew głębinowy	NP.	553	NP.
		1552	432	NP.

Posiew powierzchniowy:

Kolonie bakterii rozrosły się w taki sposób, że nie było w stanie ich policzyć.

Posiew głębinowy:

553 + 432 = 985 / 2 = 492,5

492 * 10^-4 JTK / ml = 4,9 * 10⁶ JTK / ml

Wyniki posiewu na podłoże płynne:

- zmętnienie

Wyniki posiewu na skos agarowy:

- zjeżony

Kolonie bakterii, które wyrosły na skosie agarowym miały barwę czerwoną. Zajęły one prawie cały skos, z czego można wywnioskować, że podłoże agarowe bardzo sprzyjało ich rozwojowi.

Na posiewach powierzchniowym i głębinowym kolonie bakterii również były czerwone. Bardzo często łączyły się w obszerne kolonie, które przybierały kształt kałuży, dlatego nie można było dokładnie policzyć ilości wyrosłych bakterii. Najczęściej działo się tak dla posiewu powierzchniowego, dla którego nie udało Nam się policzyć żadnej z wyhodowanych kolonii. Te bakterie, które nie łączyły się w kolonie przybierały postacie rozgałęzione lub kłębkowate. Bakterie te rosły raczej w sposób płaski lub lekko wzniesiony. Na posiewach 10^-3 wyrosłe bakterie miały mniejsze wielkości od tych wyrosłych na posiewach 10^-5, co spowodowane było mniejszym obszarem, na którym jedna bakteria mogła się rozwijać i rosnąć.

WNIOSKI:

Niedokładność obliczeń spowodował zły rozwój bakterii, które łącząc się w kolonie nie dawały się policzyć. I tak na dziewięć posiewów tylko trzy udało Nam się odszyfrować. Łączenie się bakterii w kolonie spowodowane było złym posiewaniem. Bakterie posiewane nie były należycie rozprowadzone po podłożu, co spowodowało, że zaczęły rosnąć i rozwijać się w jednym miejscu, uniemożliwiając w ten sposób ich dokładne policzenie. Nasze obliczenia nie są dokładne. Spowodowane jest to małą wielkością niektórych wyrosłych bakterii, których siłą rzeczy nie udało się policzyć, gdyż były zbyt małe i często stawały się niewidoczne w złym oświetleniu.

Warszawa 9.III.2004

- 2 -

---