PODSTAWOWE TECHNIKI MIKROBIOLOGICZNE ZWIÄ„ZANE Z POSIEWEM BAKTERII
Zakres ćwiczenia
Ćwiczenie obejmuje wykonanie szeregu rozcieńczeń w 6 probówkach i następnie posiewu bakterii z każdej probówki – dla każdej posiewu powierzchniowego i głębinowego. Drugą częścią ćwiczenia jest posiew bakterii w trzech probówkach z bulionem oraz trzech ze skosem agarowym.
Cel ćwiczenia
Zapoznanie siÄ™ z podstawowymi technikami mikrobiologicznymi zwiÄ…zanymi z posiewem bakterii.
Przebieg ćwiczenia
Przygotowujemy stanowisko – przecieramy blat denaturatem oraz rozpalamy palnik (zapobiegając ewentualnym zanieczyszczeniom próbek z powietrza).
W pierwszej kolejności wykonujemy szereg rozcieńczeń. W tym celu korzystać będziemy z pipet automatycznych – jedna ustawiona jest na pobranie 1ml, druga 0,1ml. Do dyspozycji mamy 6 probówek, każda z nich zawiera 9ml wody. Pobieramy 1ml zawiesiny i dodajemy do pierwszej probówki. W ten sposób uzyskujemy rozcieńczenie 10-1. Następnie z rozczynu otrzymanego w 1 probówce przenosimy 1ml do probówki drugiej, dostając rozcieńczenie 10-2. Postępujemy tak aż do ostatniej próbówki. Przed każdym pobraniem nowego materiału końcówki w probówkach są wymieniane. Przed pobraniem materiału i po pobraniu go wlot wszystkich naczyń jest opalany nad palnikiem.
Podpisujemy sześć gotowych płytek Petriego do posiewu powierzchniowego. Pobierając 0,1ml materiału z każdej probówki dodajemy go na odpowiednią płytkę. Następnie za pomocą wyjałowionej (najpierw zanurzonej w denaturacie, a następnie opalonej) głaszczki równomiernie rozprowadzamy materiał po pożywce. Na koniec każdą próbkę odwracamy do góry nogami. Tak przygotowane próbki poddajemy inkubacji.
Podpisujemy sześć płytek Petriego do posiewu głębinowego. Pobierając 1ml materiału z każdej probówki dodajemy go na odpowiednią płytkę. Następnie zalewamy ciepłą pożywką agarową (w stanie ciekłym), zamykamy i dobrze mieszamy ze sobą. Tak przygotowane próbki pozostawiamy do zastygnięcia i następnie odwracamy do góry nogami. Następnie trafiają one do inkubacji.
Za pomocą jałowej (wypalonej w palniku do czerwoności) ezy pobieramy materiał z kolby z zawiesiną i wkładamy ostrożnie do probówek z bulionem. Postępujemy tak samo dla trzech przygotowanych probówek. Po przygotowaniu próbki pozostawiamy na statywie.
Ponownie za pomocą jałowej ezy pobieramy materiał z kolby z zawiesiną i ostrożnie od końca skosu agarowego, wężykiem lub w linii prostej rozprowadzamy materiał po pożywce. Postępujemy tak z trzeba przygotowanymi probówkami. Gotowe pozostawiamy na statywie.
Analiza wyników
W wyniku wyliczenia powstałych kolonii na wykonanych przez nas posiewach, otrzymaliśmy:
| Rozcieńczenie | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
|---|---|---|---|---|---|
| Posiew powierzchniowy | Nie policzalne | 241 | 69 | Zakażenie | 3 (zakażenie) |
| Posiew głębinowy | Nie policzalne | Nie policzalne | Nie policzalne | 54 | 3 |
Obliczenia dla posiewu powierzchniowego:
Rozcieńczenie 10-3
241 * 103 * 10 = 2, 41 * 106 jtk/ml
Rozcieńczenie 10-4
69 * 104 * 10 = 6, 9 * 106 jtk/ml
Åšrednia:
$$\frac{2,41*10^{6} + 6,9*10^{6}}{2} = 4,66*10^{6}\ jtk/ml$$
Obliczenia dla posiewu głębinowego:
Rozcieńczenie 10-5
54 * 105 = 5, 4 * 106 jtk/ml
Rozcieńczenie 10-6
3 * 106 jtk/ml
Åšrednia:
$$\frac{5,4*10^{6} + 3*10^{6}}{2} = 4,2*10^{6}\ jtk/ml$$
Wnioski
Dwa spośród wykonanych przez nas posiewów zostały zakażone, prawdopodobnie zanieczyszczeniami z powietrza. Uznajemy tak dlatego, że obecność bakterii w próbce wraz ze wzrostem rozcieńczenia powinna maleć. W naszym przypadku stało się inaczej. Posiew powierzchniowy o rozcieńczeniu 10-5 zawierał więcej kolonii niż poprzedzające go posiewy. Natomiast patrząc na wartości otrzymane na płytkach z posiewem powierzchniowym możemy stwierdzić, że na ostatniej płytce nie powinny wyrosnąć żadne bakterie. W naszej próbce stało się inaczej, z czego wnioskujemy, że została ona zakażona z powietrza.
Zakażenie z powietrza mogło być spowodowane niedopilnowaniem przez grupę odpowiedniej sterylizacji narzędzi bądź nie opaleniem wlotu naczynia przed lub po pobraniu materiału – wówczas mogły znaleźć się tam bakterie z powietrza i zakazić próbkę.
Obliczona przez nas liczba pierwotnych bakterii (jednostek tworzących kolonie) w obu rodzajach posiewów – powierzchniowym i głębinowym – są do siebie podobne. Świadczy to o tym, że posiew wykonany był prawidłowo. Ewentualne różnice mogły wynikać z małych różnic w składzie pożywki (nawet niewielka zmiana w składzie może spowodować, że na pożywce wyrosną jeszcze dodatkowe bakterie, które w innej pożywce mogły nie znaleźć składnika niezbędnego do ich przetrwania). Na odmienności w wynikach wpływ mogły mieć także wspomniane zanieczyszczenia, które pojawiły się w próbce.
Po oględzinach posiewów w bulionie oraz na skosie agarowym stwierdzamy, że w obu przypadkach bakterie wyrosły. W bulionie widoczne było zmętnienie wcześniej klarownego roztworu, co świadczy o wzroście bakterii. Na skosie agarowym widoczne były gołym okiem wyrosłe kolonie.