ĆWICZENIE 2

PREPARATYKA PLAZMIDOWEGO DNA

I ANALIZA RESTRYKCYJNA

1. Preparatyka plazmidowego DNA

Cel doświadczenia: izolacja plazmidowego DNA z komórek E.coli metodą lizy alkalicznej

Wykonanie

Odczynniki

1. Roztwór I - bufor do rozpuszczenia osadu bakterii: 50mM glukoza, 25 mM Tris:HCl,

10 mM EDTA, końcowe pH 8,0

2. Roztwór II - bufor do lizy alkalicznej bakterii: 0,2 N NaOH (rozcieńczony

z 10 N roztworu wyjściowego), 1% SDS (sól sodowa

siarczanu dodecylu, rozcieńczony z 10% roztworu wyjściowego)

3. Roztwór III – bufor do wytrącania białek i genomowego DNA:

3M octan potasu, 2M kwas octowy

4. Bufor TE (Tris:EDTA) - do rozpuszczenia plazmidowego DNA:

10 mM Tris:HCl, 1 mM EDTA, końcowe pH 8,0

Część doświadczalna

Liza alkaliczna

1. Otrzymany osad bakteryjny całkowicie rozpuścić w 100

µ

l schłodzonego w lodzie

roztworu I, intensywnie mieszając za pomocą mieszadła wirowego (vortex).

2. Dodać 200

µ

l świeżo przygotowanego rozworu II. Dokładnie zamknąć probówkę i

wymieszać jej zawartość gwałtownie odwracając 5 razy. Cała powierzchnia probówki

powinna mieć kontakt z roztworem II. Nie używać mieszadła wirowego (vortex). Umieść

probówkę w lodzie.

3. Dodać 150

µ

l roztworu III. Probówkę zamknąć i wytrząsać łagodnie przez około 10 sek.

trzymając ją do góry dnem tak, aby lizat bakterii rozpuścił się w roztworze III. Włożyć

probówkę do łaźni lodowej na 5 minut.

4. Odwirować w 12000g w temp. 4˚C przez 5 min. w mikrowirówce. Supernatant, w którym

znajduje się plazmidowy DNA oraz RNA przenieść do nowej probówki.

5. Wytrącić plazmidowy DNA dwiema objętościami etanolu. Zamieszać za pomocą

mieszadła wirowego.

6. Odwirować przy 12000g w temp. 4˚C przez 5 min. w mikrowirówce.

7. Ostrożnie usunąć supernatant pipetą. Postawić probówkę na bibule do góry dnem, aby

pozbyć się płynu. Usunąć krople przylegające do ścianek.

8. Delikatnie przemyć osad 1 ml 50% etanolu o temp. 4˚C. Usunąć etanol w sposób opisany

w punkcie poprzednim i wysuszyć osad na powietrzu przez 10 min.

9. Rozpuścić osad w 20

µ

l buforu TE o pH 8.0, zawierającym trzustkową RNazę A

(20mg/ml), wolną od DNazy.

10. Podpisać probówki i przekazać je prowadzącemu. Preparat będzie badany na następnych

zajęciach i do tego czasu należy go przechowywać w temp. -20˚C.

Przeciętna wydajność 3-5 mg DNA/

µ

l hodowli.

Hodowla bakteryjna. Ze względu na czasochłonność, etap przygotowywania osadu bakterii, z

którego izoluje się DNA, wykonywany jest wcześniej przez pracowników Katedry. Osad

przygotowuje się z hodując jedną kolonię (pojedynczy klon) bakterii na stałej pożywce. Co

zapewnia genetyczną jednolitość hodowli. Pożywka zawiera wszystkie substancje niezbędne

do rozwoju bakterii oraz antybiotyk. Tylko klony zawierające plazmid z genem oporności na

ten antybiotyk mogą przeżyć i rozmnożyć się. Bakterie, które nie posiadają plazmidu lub,

które utraciły go w trakcie podziału, zginą. Podobne właściwości ma pożywka płynna, która

dodatkowo umożliwia uzyskanie dużej masy bakterii. Bakterie są odwirowywane z pożywki

płynnej i zbierane na dnie probówki. Usuwana jest cała pożywka, stąd tak ważne osuszenie

bocznych ścianek probówki.

Liza alkaliczna. Aby bakterie były w pełni eksponowane na działanie roztworu II, osad

bakterii jest zawieszany w roztworze I. Dlatego tak istotne jest staranne oczyszczenie osadu

bakteryjnego. Roztwór II zawiera NaOH oraz SDS - silny detergent anionowy. Łączne

działanie obu składników rozbija komórki i uwalnia do roztworu całą ich zawartość, między

innymi plazmidowy i genomowy DNA. DNA genomowy ma stosunkowo dużą masę

cząsteczkową, dlatego intensywne wstrząsanie może doprowadzić do pękania DNA na

fragmenty różnej wielkości, w tym także równe masie cząsteczkowej plazmidu. Na dalszych

etapach oczyszczania zachowywałyby się one tak samo jak plazmid i zanieczyszczałyby

uzyskany preparat. Niska temperatura chroni DNA przed strawieniem przez DNazy, a SDS

powoduje rozbicie kompleksów białkowych. Pod wpływem roztworu III (w środowisku o

niskim pH i dużej sile jonowej) białka komórki bakteryjnej i genomowe DNA ulegają

wytrąceniu.

W czasie wirowania strącone zostają fragmenty ściany komórkowej, błony komórkowej,

agregaty białek i genomowy DNA (jako największa cząsteczka). W roztworze pozostają

cząsteczki plazmidu, rRNA, tRNA oraz mRNA. W końcowym etapie zostają one strącone za

pomocą etanolu.

Po odwirowaniu na dnie probówki znajduje się plazmidowy DNA, zanieczyszczony głównie

RNA. Usunięcie supernatantu i przemycie 70% etanolem usuwa zanieczyszczenia i resztę

jonów. Osad suszy się, w celu odparowania resztek etanolu. Następnie osad plazmidowego

DNA, zanieczyszczony RNA, zostaje rozpuszczony w buforze TE zawierającym RNazę A,

trawiącą każdy rodzaj RNA. Dzięki temu w probówce pozostaje tylko plazmidowy DNA.

2. Analiza restrykcyjna plazmidowego DNA

Cel doświadczenia: Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi. Rozdział produktów

trawienia metodą elektroforezy w żelu agarozowym i ich identyfikacja za pomocą barwienia

bromkiem etydyny.

Wykonanie

Sprzęt:

1.

Zasilacz do elektroforezy

2.

Aparat do elektroforezy z grzebieniem i przewodami łączącymi z zasilaczem

3.

Pipety automatyczne z regulowaną objętości 20

µ

l i 20-200

µ

l

4.

Jałowe probówki Eppendorf

5.

Jałowe końcówki do pipet

6.

Rękawiczki ochronne, okulary chroniące przed UV

7.

Monitor UV

8.

Waga techniczna

Szkło:

1.

Kolbka stożkowa (lub butelka) do rozpuszczenia agarozy

2.

Cylinder na 1 l oraz 100 ml

Odczynniki:

1.

Enzym restrykcyjny Xho I.

2.

Enzym restrykcyjny Hind III.

3.

Bufor R dla enzymów restrykcyjnych.

4.

Bufor TBE 5x (5-krotnie stężony): 0,455 M Tris, 0,455 M kwas borowy, 0,01 M EDTA;

pH 8. Zasada przygotowania: (Tris 54g; kwas borowy 27,5g; 20 ml 0,5 M EFTA,

doprowadzić do pH 8,0, dopełnić do 1 l).

5.

Roztwór wyjściowy bromku etydyny: rozpuścić 10mg EtBr w 1 ml wody i przechowywać

w światłoszczelnym pojemniku. Odczynnik jest przygotowany wcześniej i udostępniany

przez prowadzącego zajęcia.

6.

Bufor obciążający próby (6-krotnie stężony):

0,25% błękit bromofenolowy

0,25% cyjanoksylen FF

15% Ficol (typ 400) w wodzie

Część doświadczalna

Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi

1.

Zmieszać:

5

µ

l roztworu zawierającego plazmidowy DNA

12

µ

l wody dejonizowanej

0,5

µ

l enzymu restrykcyjnego Xho I

0,5

µ

l enzymu restrykcyjnego Hind III

2

µ

l buforu R

Całość wymieszać lekko stukając w probówkę (będzie to pokazane przez prowadzącego

zajęcia).

2.

Inkubować mieszaninę reakcyjną przez 1 godz. w temp. 37

°

C. W czasie inkubacji

przygotować żel do rozdziału elektroforetycznego produktów trawienia.

Przygotowanie żelu agarozowego

1.

Założyć formę do zestalenia .żelu agarozowego ustawiając saneczki we wnętrzu aparatu

do elektroforezy prostopadle do jego długiej osi tak, aby gorąca i płynna agaroza nie

wypłynęła przed schłodzeniem i zestaleniem. Umocować grzebień w taki sposób, aby

zęby znajdowały się 0,5-1 mm nad dnem saneczek. Przed wylaniem agarozy

wypoziomować aparat.

2.

Dodać 0,5 g agarozy do 50 ml rozcieńczonego 0,5 x buforu TBE(10 ml stężonego 5x

buforu TBE dodać do 90 ml wody dejonizowanej). Aby rozpuścić agarozę należy

podgrzać roztwór do wrzenia w kuchence mikrofalowej. Następnie klarowny roztwór

ochłodzić do temperatury około 60

°

C, dodać bromku etydyny (EtBr) do końcowego

stężenia 0,5

µ

g/ml i starannie wymieszać.

UWAGA! Bromek etydyny jest mutagenem, podczas pracy z nim należy używać

rękawiczek!

3.

Wlać płynną agarozę do formy z zainstalowanym grzebieniem. Zarówno pod, jak i

pomiędzy zębami grzebienia nie powinny znajdować się pęcherzyki powietrza. Grubość

powstałego żelu powinna wynosić około 5 mm. Pozostawić agarozę do zestalenia ok. 30

min.

4.

Przygotować bufor do elektroforezy rozcieńczając 10-krotnie 5 x bufor TBE. Bardzo

ostrożnie, aby nie uszkodzić kieszonek, wyjąć grzebień z żelu agarozowego. Powstałe

otwory (kieszonki) w żelu to miejsca nakładania próbek. Saneczki z żelem wyjąć, obrócić

i ustawić wzdłuż długiej osi do aparatu. Nalać buforu do elektroforezy tak, aby pokrywał

powierzchnię żelu warstwą o grubości około 1 mm.

Elektroforeza

1.

Przygotowanie prób do elektroforezy. Zmieszać 5 objętości próbki z 1 objętością buforu

obciążającego. Można to wykonać na kawałku folii polietylenowej. Całkowita objętość

nakładanej próby nie może przekroczyć objętości kieszonki. Pojedyncza próbka nie

powinna również zawierać więcej niż 500 ng DNA/prążek, gdyż w żelu pojawią się

smugi. W przypadku dużej ilości prążków można nałożyć 20-30

µ

g DNA bez wyraźnej

utraty rozdzielczości.

2.

Nakładanie prób. Do nakładania prób do kieszonek stosuj jednorazowe końcówki typu

„cristall”. Aby uniknąć drgań końca pipety i uszkodzenia żelu, końcową część pipety

należy podtrzymać drugą ręką i powoli opróżnić mikropipetę. Sposób nakładania pokaże

prowadzący zajęcia.

3.

Przeprowadzenie elektroforezy. Nałożyć pokrywę na aparat i prawidłowo połączyć

przewodami z zasilaczem (DNA przemieszcza się w kierunku anody). Włączyć zasilacz i

ustalić napięcie na wartość 1-5 V/cm, licząc odległość pomiędzy elektrodami. Prowadźić

elektroforezę do momentu, gdy błękit bromofenolowy osiągnie około 2/3 długości żelu).

4.

Zakończenie elektroforezy. Zmniejszyć napięcie wytwarzane przez zasilacz do zera,

odłączyć przewody, wyłączyć zasilacz. Zdjąć pokrywę z aparatu. Delikatnie wyjąć

saneczki z żelem i umieścić żel na powierzchni szyby transiluminatora. śel musi

znajdować się bezpośrednio na szybie – należy go zsunąć z saneczek.

UWAGA! Promieniowanie UV jest szkodliwe dla oczu i skóry.

Podczas pracy z nim należy stosować okulary ochronne!

Z uwagi na obecność w żelu agarozowym bromku etydyny, nie należy wyrzucać go do

kosza, lecz przekazać prowadzącemu zajęcia.

Najmniejsza ilość DNA jaką można wykryć za pomocą fotografii (jest ona bardziej czuła niż

wzrok) to 2 ng w prążku o szerokości 5 mm.