Ćwiczenia 13 9.01.2013

T : Testy lekowrażliwości drobnoustrojów.

ANTYBIOGRAM :
badanie laboratoryjne, mające na celu określenie wrażliwości obecnych w próbce bakterii na
antybiotyki. Bakterie z pobranych wydzielin, np. z plwociny, hoduje się na specjalnych pożywkach
i bada się ich wzrost w obecności różnych antybiotyków. Antybiogramy wykonuje się przy ciężkich
lub nawracających infekcjach. Coraz więcej szczepów bakterii jest odpornych na niektóre
antybiotyki, wskutek często niepotrzebnego ich stosowania.

Antybiogram ---> opis wrażliwości określonego gatunku drobnoustroju na działanie określonych
antybiogramów i/lub chemioterapeutyków.

METODY OKREŚLANIA WRAŻLIWOŚCI :

a) metoda dyfuzyjno-krążkowa
b) metoda rozcieńczeniowa
c) E-test

ad.a) metoda dyfuzyjno-krążkowa
tzw. metoda Kirby-Bauera. Najczęściej używana metoda testowania lekooporności. Oparta jest na
dyfuzji zawartego w krążku do podłoża. Antybiotyk dyfunduje promieniście, tworząc gradient
stężeń. Największa jego koncentracja występuje przy brzegach krążka i spada wraz z odległością od
krążka. Większość strefy zahamowania wzrostu bakterii jest wprost proporcjonalna do stopnia
wrażliwości bakterii na antybiotyk - im większa jest strefa zahamowania, tym bakteria jest bardziej
wrażliwa. W zależności od wielkości strefy, bakterie określa się jako: wrażliwe lub oporne na
podstawie przyjętych standardów (rekomendacji). Jest to metoda dobrze wystandaryzowana,
powtarzalna, relatywnie tania.

Wrażliwy "S"---> wrażliwość drobnoustroju na standardowe dawki leku, wysokie prawdopodobień-
-stwo sukcesu klinicznego.
Średnio wrażliwy "I" ---> szczepy w zakresie MIC pomiędzy wrażliwym a opornym, sukces
terapeutyczny niepewny, może być osiągnięty, gdy lek jest zagęszczany
(np. drogi moczowe) lub może być stosowany w większej dawce
(np. przy niskiej toksyczności).
Oporny "R" ---> wysokie prawdopodobieństwo niepowodzenia terapeutycznego, niezależnie od
dawki leku i lokalizacji infekcji.

Oznaczenie lekooporności metodą krążkowo-dyfuzyjną:

* Materiały :
- podłoże agar Mueler-Hinton (MHA)
- 1 ml jałowej 0,85% soli fizjologicznej (NaCl)
- krążki bibułowe z antybiotykiem
- zawiesina bakteryjna
- wzorzec skali - jałowe wymazówki

* Wykonanie :

1. Przygotować inoculum - kilka tych samych kolonii bakterii ze świeżej, 18-godz. hodowli
bakterii zawiesić w jałowym fizjologicznym roztworze NaCl (0,85%) celem uzyskania zawiesiny o
gęstości 0,5 w skali McFarlanda, co w przybliżeniu odpowiada liczbie od

1-2 10

8

c.f.u./ml.

Gęstość

zawiesiny oznaczyć nefelometrycznie przy użyciu kolorymetru
2. W ciągu 15 min. zanurzyć w inoculum jałową wymazówkę. Usunąć nadmiar zawiesiny,
obracając i przyciskając wymazówkę mocno do ściany probówki powyżej poziomu płynu.
Zawiesinę trzykrotnie rozprowadzić na całej powierzchni podłoża, przekręcając płytkę za każdym
razem o 60°C
3. Po wyschnięciu (do 15 min.) na posiane podłoże nałożyć krążki z antybiotykami (za pomocą
sterylnej pęsety lub z zastosowaniem szablonu, co ułatwia równomierne rozmieszczenie krążków).
Każdy krążek należy delikatnie przycisnąć, zapewniając równomierny kontakt z podłożem.
4. W ciągu 15 min. płytki wstawić do cieplarki, inkubować w warunkach tlenowych 16-18 godzin,
w temp. 35C.
5. Zmierzyć średnicę każdej strefy zahamowania wzrostu drobnoustroju (wliczając średnicę krążka)
i zanotować odczyt w mm. Pomiaru stref można dokonać za pomocą linijki lub suwmiarki.
6. Interpretacja wyniku - wg rekomendacji.

Czynniki wpływające na wielkość strefy zahamowania wzrostu w metodzie krążkowo-dyfuzyjnej :

Gęstość inoculum
w przypadku zbyt małej gęstości inoculum strefa zahamowania, niezależnie od wrażliwości
mikroorganizmu będzie mniejsza - oporne szczepy mogą zostać opisane jako wrażliwe. Przy zbyt
dużej gęstości inoculum, wielkość uzyskanej strefy będzie mniejsza - szczepy wrażliwe mogą
zostać opisane jako oporne.

Czas nałożenia krążków
na posianych płytkach pozostawionych w temperaturze pokojowej dłużej niż podano, przed
nałożeniem krążków dochodzi do namnażania szczepów – w efekcie strefy zahamowania wzrostu
mogą być mniejsze i szczepy mogą zostać opisane jako oporne.
Temperatura inkubacji
w celu otrzymania optymalnego wzrostu, podłoża z antybiogramem należy inkubować w 35°C.
Jeśli temperatura jest niższa, wydłuża się czas inkubacji, a uzyskane strefy są większe.

Czas inkubacji
większość metod uwzględnia 16-18 godzinny okres inkubacji. W wyjątkowych sytuacjach wstępny
wynik może być odczytany po 6 godzinach, nie mniej wynik należy potwierdzić po odpowiednim
czasie inkubacji.

Rozmiar płytek, grubość warstwy podłoża agarowego i rozmieszczenie krążków z antybiogramem
na płytkach o średnicy 9-10 cm umieszcza się nie więcej niż 5 krążków. Na bardzo cienkich
podłożach może wytwarzać się większa strefa zahamowania, odwrotnie przy zbyt grubym podłożu.
Właściwe rozmieszczenie krążków zapobiega nakładaniu się stref zahamowania lub powstawaniu
zniekształceń przy brzegach płytki.

Stężenie antybiotyków w krążkach
średnica strefy zahamowania zależy od zawartości antybiotyku w krążku. Krążki wymagają
odpowiedniego przechowywania, zgodnie z instrukcją.

Skład podłoża
jest ściśle ustalony; podłoże wpływa na wielkość strefy, decydując o stopniu wzrostu,
współczynniku dyfuzji i aktywności leku.

KONTROLA JAKOŚCI
Precyzja i dokładność metody powinny być monitorowane za pomocą programu kontroli jakości.
Okresowo (raz w miesiącu, przy nowej serii krążków) przeprowadza się kontrole wrażliwości dla
szczepów kontrolnych o znanej lekowrażliwości. Uzyskiwanie wyników, które nie mieszczą się w
określonym zakresie, jest przypuszczalnie efektem błędu technicznego lub użycia niewłaściwych
odczynników. Należy sprawdzić każdy odczynnik i etap testu, odnaleźć i wyeliminować błąd.

ad.b) metody rozcieńczeniowe
pozwalają na określenie minimalnego stężenia antybiotyku (MIC – minimum inhibitory
concetration) hamującego wzrost bakterii. Seryjne rozcieńczenia antybiotyku przygotowuje się w
podłożu płynnym lub podłożu agarowym, do których następnie dodaje się odpowiednie inoculum i
inkubuje. Metody pracochłonne, wykorzystywane głównie w badaniach naukowych.
W niektórych gotowych systemach (ręczne, automatyczne) stosowane są metody półilościowe.
Określa się w nich hamowanie wzrostu bakterii na 2 lub 3 stężenia krytyczne (ang. breakpoint –
wartość graniczna - określona wartość MIC lub wartość strefy zahamowania wzrostu wokół
antybiotykiem kwalifikująca szczep jako: S, I, R) dla stopni wrażliwości S, I, R.
Metodę dodawania leku do pożywki (można przygotować jedno lub dwa stężenia) wykorzystuje się
do określenia wrażliwości na antybiotyki i chemioterapeutyki drobnoustrojów wolno rosnących na
podłożach sztucznych np. prątki gruźlicy.

ad.c) E-test
łączy dyfuzję antybiotyku w agarze i ilościowe określenie stężenia hamującego – MIC.
Wykorzystuje się paski nasycone antybiotykiem w gradiencie stężeń.

----------------------------------------------------------------------------------------------

PRZYGOTOWAĆ PROJEKT :

1) czy to są antybiotyki czy chemoterapeutyki
2) jakie spectrum jest jego działania
3) czy dany lek może być zastosowany

---------------------------------------------------------------------------------------

Wybrałam sobie Staphylococcus aureus

Antybiogram i strefa zahamowania antybiotyków lub chemioproteotyków

* P10 ---> Penicylina,
I gen.,

Strefa zahamowania wzrostu (mm) :

R

I

S

Bakterie

poniżej lub równe

równe lub powyżej

28

29

Staphylococcus spp.

14

15

enterokoki

19

20-27

28

Streptococcus spp. z wyjątkiem
Streptococcus pneumoniae

U mnie strefa zahamowania wynosi 28 mm, więc należy do Oporny "R"

* CN10 ---> Gentamycyna,
aminoglikozyd

R

I

S

poniżej lub równe

równe lub powyżej

12

13-14

15

U mnie strefa zahamowania równa 15 mm, więc należy do Wrażliwy "S"

* KZ30 ---> Cefazolina
cefalosporyny
I gen.

R

I

S

poniżej lub równe

równe lub powyżej

14

15-17

18

U mnie strefa zahamowania wynosi 18 mm, więc należy do Wrażliwy "S"

* AMC30 ---> Amoksycyklina/kwas klawulonowy

R

I

S

Bakterie

poniżej lub równe

równe lub powyżej

19

20

Staphylococcus spp.

13

14-17

18

inne bakterie

U mnie strefa zahamowania wynosi 19 mm, więc należy do Oporny "R"

* TOB10 ---> Tobramycyna

R

I

S

poniżej lub równy

równy lub powyżej

12

13-14

15

U mnie strefa zahamowania równa się 19 mm, więc zaliczamy do Wrażliwy "S"

* FOX30 ---> Cefoksytyna
cefalosporyny
II gen.

R

I

S

Bakterie

poniżej lub równy

równy lub poniżej

21

22

Staphylococcus aureus i
Staphylococcus lugdunensis

24

25

koagulazo-ujemne

14

15-17

18

gronkowce, rodzina Enterobacteriaceae

U mnie strefa zahamowania wynosi 22 mm, więc zaliczamy do Wrażliwy "S"