plik

Postępy Biochemii 59 (1) 2013

Dorota Grabek-Lejko

Vladimir Sibirny

Andriy Sibirny

1,2,

Uniwersytet Rzeszowski, Rzeszów

Instytut Biologii Komórki Narodowej Akade-

mii Nauk Ukrainy, Lwów, Ukraina



Uniwersytet Rzeszowski, ul. Zelwerowicza 4,

35-601 Rzeszów, Polska, tel. (17) 785 54 40 lub

Instytut Biologii Komórki Narodowej Akade-

mii Nauk Ukrainy, ul. Dragomanowa 14/16,

Lwów 79005 Ukraina, e-mail: sibirny@yahoo.

com

Artykuł otrzymano 28 czerwca 2012 r.

Artykuł zaakceptowano 6 grudnia 2012 r.

Słowa kluczowe: drożdże metylotroficzne,

ekspresja genów, Hansenula polymorpha, Pichia

pastoris, Pichia methanolica, Candida boidinii

Wykaz skrótów: ARS — autonomicznie re-

plikujące się sekwencje (ang. autonomously re-

plicating sequence); DAS — syntaza dihydrok-

syacetonu; DHA — dihydroksyaceton; DHAP

— fosforan dihydroksyacetonu; FAD — dinu-

kleotyd flawinoadeninowy; GAP — aldehyd

3-fosfoglicerynowy; GSH — glutation; NAD

NADH — dinukleotyd nikotynamidoadenino-

wy utleniony/zredukowany

Regulacja ekspresji genów w komórkach drożdży metylotroficznych

STRESZCZENIE

rożdże metylotroficzne to unikalne organizmy eukariotyczne, które potrafią metaboli-

zować toksyczny, jednowęglowy substrat, jakim jest alkohol metylowy. Znanych jest

około 50 gatunków drożdży metylotroficznych, spośród których najlepiej zbadane zostały 4

gatunki:

Pichia methanolica, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris i Сandida boidinii. Po-

wyższe organizmy, a szczególnie

P. pastoris i H. polymorpha są perspektywicznymi produ-

centami białek heterologicznych i obecnie wykorzystuje się je do przemysłowej produkcji

niektórych z nich. W niniejszym przeglądzie przedstawiono organizację genomu, sposoby

regulacji ekspresji genów oraz zasady wykorzystania promotorów tych gatunków drożdży

do konstruowania producentów białek heterologicznych. Analizowano szczególnie prace

dotyczące genetycznej kontroli węglowej i azotowej represji katabolicznej u

H. polymorpha.

Przedstawiono również prace dotyczące identyfikacji metabolitów indukujących represję

kataboliczną oraz selektywną autofagię peroksysomów u drożdży

Pichia methanolica rosną-

cych na podłożu z etanolem.

WPROWADZENIE

Drożdże, podobnie jak inne mikroorganizmy, wykorzystują do swojego

wzrostu w pierwszej kolejności fermentowalne źródła węgla, takie jak glukoza.

W przypadku ich braku lub zużycia, mogą wykorzystywać także niefermento-

walne źródła węgla, takie jak glicerol, etanol czy metanol. Drożdże wykorzystu-

jące metanol, jako jedyne źródło węgla i energii, zwane są drożdżami metylo-

troficznymi. Należą one między innymi do rodzajów: Candida, Pichia, Hansenula.

Obecność glukozy w podłożu powoduje u tych organizmów represję szlaku me-

tabolizmu metanolu na drodze glukozowej represji katabolicznej. Z kolei brak

glukozy i obecność metanolu w podłożu powoduje indukcję szlaku metylotro-

ficznego. Mechanizm tej regulacji zwany jest również derepresją lub indukcją

metanolową. Metanol jest silnym induktorem promotorów genów kodujących

enzymy niezbędne dla metabolizmu tego jednowęglowego substratu. W oparciu

o te promotory opracowano efektywne systemy ekspresji białek heterologicz-

nych u kilku gatunków drożdży metylotroficznych, takich jak: Pichia pastoris,

Hansenula polymorpha, Pichia methanolica i Candida boidinii.

Poznanie genomu oraz mechanizmów regulacji ekspresji genów szlaku me-

tylotroficznego jest niezwykle istotne, gdyż w pełni umożliwi wykorzystanie

ogromnego potencjału tych gatunków drożdży w różnych procesach biotech-

nologicznych [1].

METABOLIZM METANOLU U DROŻDŻY

Analiza mechanizmów regulacji metabolizmu metanolu u drożdży wymaga

przedstawienia szlaku katabolizmu tego jednowęglowego substratu oraz enzy-

mów w nim uczestniczących. Reakcje enzymatyczne zachodzące w szlaku ka-

tabolizmu metanolu są analogiczne u wszystkich dotąd zbadanych gatunków

drożdży, dlatego też opisano je bez uwzględniania gatunku.

Pierwsza część szlaku metylotroficznego przebiega w peroksysomach, nato-

miast druga w cytosolu. W pierwszym etapie utylizacji zachodzącym w perok-

sysomach, metanol, w reakcji katalizowanej przez enzym oksydazę alkoholową

(EC 1.1.3.13), utleniany jest do dwóch toksycznych związków: formaldehydu i

nadtlenku wodoru. H

może być rozłożony do tlenu i wody nie tylko przez

katalazę (EC 1.11.1.6) [2,3], ale również przez białko błony peroksysomalnej,

Pmp20 (peroksyredoksynę) [4] (Ryc. 1). Formaldehyd natomiast może być utle-

niony w kilku kolejnych reakcjach do dwutlenku węgla (szlak dysymilacyjny)

lub zostać zasymilowany do wielowęglowych związków poprzez kondensację

z ksylulozo-5-fosforanem (szlak asymilacyjny). Oddziaływanie formaldehydu

z ksylulozo-5-fosforanem katalizowane jest przez odpowiednią transketolazę,

syntazę dihydroksyacetonu (DAS) (EC 2.2.1.3) zlokalizowaną w peroksysomach

www.postepybiochemii.pl

[3]. DAS przekształca formaldehyd i ksylulozo-5-fosforan

do dwóch trójwęglowych związków: dihydroksyacetonu

(DHA) oraz aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GAP), które w

kolejnych reakcjach metabolizowane są w cytosolu (Ryc. 1).

DHA ulega fosforylacji pod wpływem kinazy dihydroksy-

acetonu (EC 2.7.1.29), tworząc fosforan dihydroksyacetonu

(DHAP). DHAP oraz GAP metabolizowane są w szlakach

pentozofosforanowym i glikolizy, w których z trzech czą-

steczek formaldehydu powstaje netto jedna cząsteczka

związku trójwęglowego oraz odtwarzany jest ksylulozo-

-5-fosforan. Jedna trzecia powstałych cząsteczek DHAP wy-

korzystana zostaje natomiast w procesie glukoneogenezy

[2,5].

Formaldehyd powstający w peroksysomach w reakcji

oksydazy alkoholowej, może być w tych organellach za-

symilowany do związków wielowęglowych lub wydzielo-

ny do cytosolu, gdzie ulega dysymilacji do CO

i H

O. W

szlaku dysymilacyjnym nie bierze udziału wolny formal-

dehyd, tylko produkt jego spontanicznej reakcji z glutatio-

nem (GSH). Powstały S-hydroksymetyloglutation zostaje

utleniony w kolejnych dwóch reakcjach katalizowanych

przez zależną od GSH i NAD

dehydrogenazę formalde-

hydu (EC 1.2.1.1) oraz zależną od NAD

dehydrogenazę

mrówczanową (EC 1.2.1.2). Produktem reakcji katalizowa-

nej przez pierwszą z dehydrogenaz jest S-formylogluta-

tion, natomiast substratem dla drugiej dehydrogenazy jest

mrówczan. Przemiana formyloglutationu do mrówczanu

zachodzi w dodatkowej reakcji enzymatycznej katalizo-

wanej przez hydrolazę S-formyloglutationu (EC 3.1.2.12).

U drożdży H. polymorpha hydrolaza S-formyloglutationu

związana jest z dehydrogenazą formaldehydu [3]. Przyj-

muje się, że NADH, powstały w dwóch kolejnych reakcjach

odwodorowania, wykorzystywany jest do produkcji ener-

gii w postaci ATP podczas wzrostu drożdży na metanolu

[6]. Istnieje również alternatywna hipoteza, według której

głównym celem utleniania formaldehydu w cytoplazmie

jest jego detoksykacja [7]. Częściowa detoksykacja może

zachodzić również w reakcji katalizowanej przez reduktazę

formaldehydu, będącej odwrotnością reakcji katalizowanej

przez dehydrogenazę alkoholową [2]. Mutanty z defektem

dehydrogenazy formaldehydu są znacznie bardziej wrażli-

we na egzogenny metanol, niż mutanty z defektem dehy-

drogenazy mrówczanowej, co świadczy o znacznie wyższej

toksyczności formaldehydu w porównaniu do mrówczanu

[6-8]. Szlak dysymilacji metanolu odgrywa główną rolę w

metabolizmie metylowanych źródeł azotu, takich jak me-

tyloamina czy cholina, gdzie formaldehyd jest produktem

ubocznym [9] (Ryc. 1).

Hansenula polymorpha

Hansenula polymorpha to gatunek drożdży o niezwyle wy-

sokiej termotolerancji rosnący w rekordowo wysokich tem-

peraturach, do 50

С [10]. Maksymalna temperatura wzrostu

tego organizmu jest najwyższa spośród wszystkich znanych

gatunków drożdży oraz tylko o 10

С niższa od najwyższej

temperatury, w jakiej mogą rosnąć znane organizmy eu-

kariotyczne. Gatunek ten jest wykorzystywany na szeroką

skalę w badaniach biotechnologicznych oraz w przemyśle i

spośród drożdży metylotroficznych ustępuje jedynie droż-

dżom Pichia pastoris. H. polymorpha, wspólnie z P. pastoris,

jest najlepszym obiektem dla badań w zakresie biologii ko-

mórki, zwłaszcza biogenezy i degradacji peroksysomów.

Ponadto H. polymorpha jest jedynym gatunkiem drożdży

metylotroficznych wykorzystywanym do konstruowania

producentów bioetanolu z surowców roślinnych oraz gli-

ceryny [11,12]. H. polymorpha jest również konkurencyjnym

producentem glutationu w stosunku do innych drożdżo-

wych i bakteryjnych producentów [13].

DOSTĘPNE SZCZEPY

Obecnie w badaniach wykorzystywane są trzy szczepy

H. polymorpha o różnym pochodzeniu: DL-1, CBS4732 oraz

NCYC495. Szczepy CBS4732 i NCYC495 wykazują wyso-

ką homologię w sekwencji nukleotydowej genów. Szczep

DL-1 nie krzyżuje się ze szczepami CBS4732 i NCYC495,

natomiast te dwa ostatnie można ze sobą krzyżować [14].

W systematyce drożdży miejsce dla szczepów podanych

jako H. polymorpha nie jest do końca określone. Rodzaj

Hansenula H. i P. Sydow zawiera askosporogenne gatunki

o komórkach kształtu kulistego, owalnego, wydłużonego

lub cylindrycznego. Worki tych gatunków zawierają od 1

do 4 zarodników. Większość gatunków z rodzaju Hansenula

jest heterotallicznych, natomiast H. polymorpha jest również

gatunkiem homotallicznym, zdolnym do przejścia z formy

haploidalnej do diploidalnej [15].

Komórki drożdży H. polymorpha akumulują trehalozę,

jako czynnik ochronny podczas wzrostu w wysokich tem-

peraturach. Termotolerancyjność może być dodatkowo

zwiększona poprzez delecję genu ATH1, kodującego enzym

kwaśną trehalazę lub poprzez nadekspresję genów HSP16

oraz HSP104 kodujących białka szoku cieplnego [10].

Po analizie reasocjacji DNA/DNA zaproponowano li-

kwidację rodzaju Hansenula i zmianę nazwy H. polymorpha

na Pichia angusta, gdyż rodzaj Hansenula różni się od Pichia

tylko zdolnością do asymilacji azotanów jako źródła azotu

[16]. Wielu czołowych ekspertów w dziedzinie taksonomii

drożdży zaakceptowało tę zmianę. Proponowane były rów-

nież inne nazwy dla tego gatunku: Torulopsis methanothermo,

Hansenula angusta i Ogataea polymorpha [17]. Według ostat-

nich danych, szczepy H. polymorpha CBS4732 i NCYC495

należą do gatunku Ogataea polymorpha a szczep H. polymor-

Rycina 1. Schemat metabolizmu metanolu u drożdży [64]. 1 — oksydaza alko-

holowa, 2 — katalaza, 3 — dehydrogenaza formaldehydu, 4 — dehydrogenaza

mrówczanowa, 5- syntaza dihydroksyacetonu, 6- kinaza dihydroksyacetonu, 7-

aldolaza fruktozo-1,6-bifosforanu, 8 — fruktozo-1,6-bifosfataza, 9 — reduktaza

formaldehydu; rekacje przegrupowania szkieletu węglowego w szlaku pentozo-

fosforanowym.

Postępy Biochemii 59 (1) 2013

pha DL-1 do gatunku Ogataea parapolymorpha (G.I. Naumov,

informacja ustna). W niniejszym przeglądzie używana jest

ogólnie przyjęta nazwa H. polymorpha.

METODY GENETYCZNE

W doświadczeniach genetycznych wykorzystuje się

szczepy CBS4732 i NCYC495 oraz ich pochodne. Szczep

NCYC495 okazał się najlepszym pod względem zdolności

do koniugacji i sporulacji, jednak wykazuje on słaby wzrost

w podłożu z metanolem. Ze szczepu CBS4732 o nieefektyw-

nej sporulacji i koniugacji skonstruowano i wyizolowano

szczepy charakteryzujące się efektywną koniugacją i spo-

rulacją oraz zwiększoną zdolnością do tworzenia czteroza-

rodnikowych worków, umożliwiając tym samym analizę

tetrad. Spośród tych mutantów wyizolowano następnie 30

mutantów auksotroficznych oraz mutanty innych typów

(m.in. o zmienionej morfologii czy też z niezdolnością do

asymilacji różnych źródeł węgla). Większość analizowa-

nych w tych szczepach markerów wykazywała typową

mendlowską segregację podczas mejozy. Częstotliwość

formowania się worków zawierających po 4 spory była w

tym przypadku niższa aniżeli u Saccharomyces cerevisiae, co

świadczy o niższej częstości rekombinacji w trakcie drugie-

go podziału mejotycznego [14].

Trzeci z przedstawionych szczepów tj. DL-1 okazał się

doskonałym obiektem do prowadzenia badań moleku-

larno-genetycznych. Zalety tego szczepu to najwyższa

szybkość wzrostu oraz wysoka częstość rekombinacji ho-

mologicznej [18]. Opracowano i adaptowano wiele metod

badawczych umożliwiających prowadzenie badań mole-

kularnych u drożdży H. polymorpha. Skonstruowano tzw.

kasetę „pop-out”, z genem HpURA3 jako markerem selek-

cyjnym, wykorzystywaną do pozytywnej selekcji transfor-

mantów z użyciem wektorów ekspresyjnych. Pierwotnie

metoda transformacji z wykorzystaniem mutantów ura3 i

genu URA3, jako markera selekcyjnego, opracowana zosta-

ła dla szczepu CBS4732 [19]. Do transformacji wykorzystuje

się także mutanty leu2 i heterologiczny gen LEU2 z S. ce-

revisiae jako marker selekcyjny [20]. Dostosowano również

metody z wykorzystaniem kilku dominujących markerów

oporności do antybiotyków, takich jak genetycyna (G418)

oraz zeocyna [11]. Transformację prowadzono różnymi

metodami: z wykorzystaniem chlorku litu (LiCl), użyciem

protoplastów w obecności glikolu polietylenowego [21] lub

elektroporacji [22]. Opracowano również metody dysrupcji

genów u H. polymorpha, w tym z wykorzystaniem zmodyfi-

kowanego systemu Cre-loxP [18].

GENOM H. polymorpha

Obecnie znane są sekwencje genów omówionych powy-

żej 3 szczepów H. polymoprha. Całkowity genom szczepu

CBS4732 został zbadany [23], ale dostęp do tej informacji

nie jest w tej chwili możliwy, ponieważ firma Rhein Bio-

tech GmbH, właściciel sekwencji, utraciła do niej dostęp (M.

Piontek, informacja ustna). Z kolei opis genomu szczepu

DL-1 jest własnością Koreańskiego Instytutu Badawczego

Nauk Biologicznych i Biotechnologii KRIBB (H.A. Kang,

informacja ustna). Dane na temat sekwencji nukleotydów

w genomie szczepu NCYC495 są efektem niedawno zakoń-

czonego projektu badawczego jednego z autorów tego prze-

glądu (A Sibirny), dotyczącego opracowania kompletnej se-

kwencji genomu w Joint Genome Institute, US Department

of Energy i są to informacje ogólnodostępne (patrz: http://

genome.jgi-psf.org/Hanpo1/Hanpo1.home.html).

Elektroforeza pulsacyjna DNA 9 różnych szczepów H.

polymorpha wykazała znaczne różnice w ilości chromoso-

mów u poszczególnych szczepów — od 2 do 6. Jednakże na

podstawie otrzymanych wyników nie można wnioskować

o dokładnej ilości chromosomów u badanych drożdży [24].

Elektroforeza pulsacyjna materiału genetycznego H. poly-

morpha CBS4732 i DL-1 wykazała, że oba szczepy posiadają

po 6 chromosomów o rozmiarach od 0,9 do 1,9 Mb, chociaż

obraz elektroforetyczny tych chromosomów u obu szcze-

pów jest zupełnie inny. Identyczność sekwencji otwartych

ramek odczytu wybranych genów wahała się od 94,5 do

97,2%, ze średnią 96,6%. Świadczy to o bliskim pokrewień-

stwie obu szczepów. Różnice w sekwencjach są znacznie

bardziej istotne dla 5’ i 3’ sekwencji nietranslacyjnych, które

mogą brać udział w regulacji ekspresji genów.

Sekwencjonowanie materiału genetycznego szczepu

CBS4732 pozwoliło scharakteryzować 8,733 Mb połączo-

nych w 48 kontigów. Sekwencja ta obejmuje około 90%

całego genomu o rozmiarze 9,5 Mb, rozmieszczonego na 6

chromosomach o wielkości od 0,9 do 2,2 Mb. W sekwen-

cjonowanym fragmencie o rozmiarze 8,73 Mb wykazano

obecność 5848 otwartych ramek odczytu dla białek o roz-

miarach większych niż 80 aminokwasów. Zidentyfikowa-

no 389 otwartych ramek odczytu dla białek zawierających

mniej niż 100 aminokwasów. 4771 otwartych ramek odczy-

tu (81,6%) wykazuje homologię w stosunku do znanych

białek

Wykazano, że średnia gęstość rozmieszczenia genu

w obrębie genomu, to 1 gen na 1,5 Kb, natomiast białko za-

wiera średnio 440 aminokwasów. Wykorzystując program

GeneWise wykazano obecność 91 intronów w genomie.

Zidentyfikowano ponadto 80 różnych tRNA odpowiadają-

cych wszystkim 20 aminokwasom.

Analiza funkcjonalna genomu (anotacja) umożliwiła po-

dział genów w zależności od prawdopodobnie pełnionych

funkcji: 4% — metabolizm energetyczny, 3% — przekazy-

wanie sygnałów, komunikacja komórkowa, 6% — synteza

białek, 4% — odpowiedź na stres, obrona komórkowa, 9%

— transport, 9% — cykl komórkowy, 17% — obróbka bia-

łek, 13% — transkrypcja, 19% — metabolizm [15].

Genom H. polymorpha (NCYC495 leu1.1) ma rozmiar oko-

ło 8,97 Mb i zawiera 5162 otwartych ramek odczytu (http://

genome.jgi-psf.org/Hanpo1/Hanpo1.home.html). Na pod-

stawie danych sekwencjonowania opracowano system

analizy ekspresji RNA. System ten wykorzystywany jest

obecnie do analizy regulacji transkrypcji u H. polymorpha, a

w szczególności regulacji ekspresji genów w zależności od

źródeł węgla [25].

MECHANIZMY INDUKCJI SYNTEZY

BIAŁEK U H. polymorpha

U H. polymorpha, podobnie jak u innych drożdży metylo-

troficznych, metanol indukuje syntezę enzymów szlaku me-

tylotroficznego, zlokalizowanych zarówno w cytosolu (de-

hydrogenaza formaldehydu, dehydrogenaza mrówczanu,

kinaza dihydroksyacetonu, fruktozo-1,6-bisfosfataza), jak i

w peroksysomach (oksydaza alkoholowa, katalaza, syntaza

www.postepybiochemii.pl

dihydroksyacetonu), a także indukuje wzrost i proliferację

peroksysomów [26]. Przeniesienie komórek z podłoża z

metanolem na podłoże z glukozą lub etanolem powoduje

represję syntezy tych enzymów oraz jednocześnie autofa-

giczną degradację peroksysomalnych enzymów kataboli-

zmu metanolu [26,27].

Analiza transkrypcyjna genomu H. polymorpha wykaza-

ła, że po 2 godzinach od przeniesienia komórek z podłoża

zawierającego glukozę na podłoże z metanolem, 1184 geny

z około 6000 znanych (około 20%) wykazywało co najmniej

dwukrotnie zwiększony poziom ekpresji, z kolei ekspresja

innych 20% genów (1246) uległa dwukrotnemu zmniej-

szeniu. Najwyższą indukcję ekspresji zaobserwowano dla

genów głównego regulatora metabolizmu metanolu MPP1

(394 razy) i FMD, kodującego dehydrogenazę mrówczano-

wą (347 razy). Indukcja ekspresji pozostałych genów meta-

bolizmu metanolu była znacznie słabsza (do 40 razy). Meta-

nol nieznacznie aktywował ekspresję genów PEX, kodują-

cych białka peroksysomalne (do 5 razy), a także niektórych

genów ATG uczestniczących w peksofagii (także do 5 razy).

Silnie aktywowana była natomiast ekspresja genów kodu-

jących enzymy β-oksydacji kwasów tłuszczowych, szlaku

glioksylowego oraz w szczególnym stopniu (111 razy) mi-

tochondrialnego transportera kreatyniny [28].

Produkt genu MPP1 należy do rodziny białek Zn(II)

Cys

regulatorów transkrypcji. Mutant mрр1 nie wykazywał

wzrostu na podłożu z metanolem jako jedynym źródle węgla

i energii oraz charakteryzował się silnie obniżonym pozio-

mem białek peroksysomalnych oraz enzymów katabolizmu

metanolu, a jednego z nich, syntazy dihydroksyacetonu, nie

posiadał w ogóle. Dla mutanta mрр1 obecność metanolu w

podłożu nie prowadziła do proliferacji peroksysomów, ko-

mórki posiadały tylko po jednym peroksysomie, który nie

ulegał degradacji po przeniesieniu tych komórek na podło-

że z glukozą. Mechanizm aktywacji trakskrypcji produktem

genu MPP1 pozostaje jednak niewyjaśniony [29]. Gen MPP1

u H. polymorpha przypomina odkryte w późniejszym termi-

nie czynniki traksrypcyjne innych gatunków drożdży jak

MXR1 P. pastoris [30] i TRM1 C. boidinii [31], które także są

niezbędne dla ekspresji genów metabolizmu metanolu oraz

biogenezy peroksysomów.

KONTROLA GENETYCZNA WĘGLOWEJ

REPRESJI KATABOLICZNEJ U H. polymorpha

Węglowa represja kataboliczna to proces polegający na

tym, że obecność łatwo przyswajalnego substratu węglo-

wego, np. glukozy wywołuje represję syntezy enzymów

potrzebnych do wykorzystania innych potencjalnych sub-

stratów [32]. Zarysy mechanizmów represji katabolicznej

poznane są dla drożdży z gatunku S. cerevisiae, jednak prak-

tycznie nie są wyjaśnione dla drożdży metylotroficznych.

U S. cerevisiae represja kataboliczna kontrolowana jest na

poziomie transkrypcji poprzez represory transkrypcyjne

MIG1 oraz MIG2, aktywatory trakskrypcji oraz różne ki-

nazy białkowe [32,33]. Znana jest także istotna rola genu

HXK2 (kodującego heksokinazę 2) w represji katabolicznej

u S. cerevisiae [32].

U H. polymorpha represja kataboliczna indukowana jest

zarówno przez glukozę jak i etanol, przy czym etanol wy-

biórczo hamuje wyłącznie syntezę enzymów metabolizmu

metanolu, podczas gdy glukoza dodatkowo hamuje także

syntezę enzymów niezbędnych dla metabolizmu innych al-

ternatywnych substratów węglowych, np. maltozy [34,35].

W przeciwieństwie do H. polymorpha, etanol nie powoduje

represji katabolicznej u S. cerevisiae. Mechanizm represji ka-

tabolicznej indukowany etanolem nie został zbadany u H.

polymorpha, w przeciwieństwie do innego gatunku drożdży

metylotroficznych P. methanolica (patrz niżej). U H. polymor-

pha badano wpływ glukozy na syntezę enzymów kataboli-

zmu metanolu i maltozy. Istnieje wiele doniesień o mutan-

tach H. polymorpha zdolnych do syntezy peroksysomów i

enzymów metabolizmu metanolu w podłożu z glukozą, bez

metanolu [36-39].

Jednakże właściwości niektórych mutantów nie były do

końca zbadane, stąd też nie zostały zidentyfikowane uszko-

dzone geny [36,38]. U jednego z mutantów z uszkodzoną

represją pokazano, że mutacja ta jest recesywna, monoge-

nowa i oznaczono ją jako glr1. Mutacja ta prowadziła do

syntezy enzymów metabolizmu metanolu, ekspresji mRNA

oksydazy alkoholowej oraz syntezy peroksysomów na pod-

łożu z glukozą, ale bez metanolu. Mutacja ta nie wpływała

na zmiany w represji enzymów szlaku metylotroficznego

przez etanol, co świadczy o istnieniu u H. polymorpha dwóch

odrębnych mechanizmów represji katabolicznej indukowa-

nych glukozą i etanolem [37]. W innej pracy dowiedzio-

no, że glukozowa represja kataboliczna enzymów szlaku

metylotroficznego (oksydazy alkoholowej i katalazy) była

zniesiona u podwójnego mutanta H. polymorpha z defektem

heksokinazy i glukokinazy (dwóch enzymów katalizują-

cych fosforylację glukozy). U pojedynczych mutantów, z

defektem glukokinazy lub heksokinazy glukoza w dalszym

ciągu powodowała represję enzymów metabolizmu me-

tanolu. Dla zniesienia represji katabolicznej indukowanej

przez fruktozę wystarczył tylko defekt heksokinazy (enzy-

mu katalizującego fosforylację fruktozy). Można wniosko-

wać, że glukozowa czy fruktozowa represja kataboliczna u

H. polymorpha wymaga obecności odpowiednich enzymów

katalizujących fosforylację tych cukrów [40]. Wprowadze-

nie natywnego genu glukokinazy do podwójnego mutanta

z blokiem glukokinazy i heksokinazy przywracało zdolność

do fosforylacji glukozy i represję kataboliczną w podłożu

z tym cukrem [41], a genu heksokinazy, represję w pod-

łożach z glukozą lub fruktozą [42]. Z kolei wprowadzenie

genu glukokinazy H. polymorpha do potrójnego mutanta S.

cerevisiae z defektem trzech enzymów, dwóch heksokinaz

i glukokinazy, nie przywracało represji katabolicznej, co

świadczy o różnych rolach enzymów fosforylujących glu-

kozę w represji katabolicznej drożdży metylotroficznych i

piekarskich [41].

Otrzymano również mutanta H. polymorpha gcr1 ze znie-

sioną represją kataboliczną. Mutant ten charakteryzował

się plejotropowym uszkodzeniem metabolizmu, zwłaszcza

konstytutywną syntezą enzymów peroksysomalnych (oksy-

dazy alkoholowej i katalazy) i konstytutywną proliferacją

peroksysomów na podłożu z glukozą (ale nie etanolem);

zmniejszeniem puli intermediatów glikolizy przy niezmie-

nionym poziomie enzymów glikolitycznych; naruszeniem

represji katabolicznej enzymów cytosolowych tj. dehydro-

genaz: formaldehydu i mrówczanu oraz α-glukozydazy. In-

Postępy Biochemii 59 (1) 2013

teresującym jest, że u mutanta gcr1 transport glukozy został

uszkodzony, szczególnie przy niskim stężeniu tego cukru,

dlatego nie można wykluczyć, ze białko Gcr1 jest trans-

porterem glukozy. Można wywnioskować również, że do

represji katabolicznej wymagany jest efektywny transport

i fosforylacja cukru. U mutanta gcr1 wykazano zaburzenie

represji katabolicznej również przy wysokim stężeniu glu-

kozy w podłożu, chociaż pobieranie tego cukru z podłoża

zachodziło porównywalnie do dzikiego szczepu. Sugero-

wano więc, że białko Gcr1, oprócz funkcji transportowych,

uczestniczy w przekazywaniu sygnału regulatorowego w

procesie represji katabolicznej. Ponadto mutacja gcr1 nie

uszkadzała inicjowanej przez glukozę autofagicznej degra-

dacji peroksysomów (peksofagii). Można wnioskować za-

tem, że rozpoznawanie glukozy w procesach inicjowanych

przez glukozę może odbywać się różnymi sposobami [39].

Zidentyfikowano również dwa nowe geny H. polymor-

pha HXS1 i HXT1, kodujące receptor heksoz i transporter

glukozy. Podobnie do innych sensorów, sensor Hxs1 okazał

się niezbędnym do indukcji przez glukozę syntezy trans-

portera glukozy Hxt1. U mutanta z delecją genu HXS1 nie

zaobserwowano zaburzeń represji katabolicznej czy auto-

fagicznej degradacji peroksysomów w podłożu z glukozą,

natomiast zaburzona była represja w podłożu z fruktozą.

Zamiana jednej konserwatywnej reszty aminokwasu w biał-

ku Hxs1 (R203K) przekształcała białko do konstytutywnie

aktywnej formy. Prowadziło to do zwiększenia oporności

wobec antymicyny A, przypuszczalnie jako konsekwencja

nadprodukcji transporterów heksoz, w tym łącznie ze zi-

dentyfikowanym Hxt1 [43].

Reasumując, można stwierdzić, że H. polymorpha posiada

kilka receptorów i transporterów heksoz. Zidentyfikowane

receptory uczestniczą w represji katabolicznej, jednocześnie

nie biorą udziału w glukozowej autofagicznej degradacji

peroksysomów (peksofagii). Przypuszczalnie rozpoznawa-

nie glukozy w procesach represji katabolicznej i peksofagii

zachodzi z udziałem różnych białek.

W celu wyjaśnienia innych elementów mechanizmu re-

presji katabolicznej u H. polymorpha, zidentyfikowano homo-

logi represorów transkrypcyjnych S. cerevisiae MIG1, MIG2

i TUP1, które u drożdży piekarskich pełnią istotną funkcję

w regulacji represji katabolicznej, oraz wyizolowano odpo-

wiednie mutanty delecyjne. Niespodziewanie okazało się,

że u pojedynczego mutanta mig1 oraz podwójnego mutanta

mig1 mig2, a także tup1 represja kataboliczna syntezy oksy-

dazy alkoholowej i katalazy w podłożu z glukozą była tyl-

ko nieznacznie zaburzona. Jednocześnie powyższe mutacje

prowadziły do silnego uszkodzenia peksofagii inicjowanej

zarówno glukozą, jak i etanolem. Uzyskane dane wskazują

na istotne różnice w mechanizmach represji katabolicznej

między drożdżami piekarskimi i metylotroficznymi. U H.

polymorpha dla represji katabolicznej ważnym wydaje się

prawidłowe funkcjonowanie transporterów, receptorów i

enzymów fosforylujących heksozy. Mechanizmy uczestni-

czące w przenoszeniu sygnału od fosforylowanych heksoz

do promotorów genów wrażliwych na kataboliczną repre-

sję pozostają niewyjaśnione. Prawdopodobnie represja nie

zachodzi z udziałem homologów represorów transkrypcyj-

nych S. cerevisiae MIG1, MIG2 i TUP1 [44]. Tym sposobem

wyjaśnienie molekularnych mechanizmów represji katabo-

licznej u drożdży metylotroficznych pozostaje wciąż aktual-

nym wyzwaniem dla naukowców.

METABOLIZM AZOTANóW ORAZ

AZOTOWA REPRESJA KATABOLICZNA

Asymilacyjna redukcja azotanów jest główną drogą prze-

miany azotowych związków nieorganicznych do związków

organicznych. Tradycyjnie, genetyczne, biochemiczne i mo-

lekularne badania asymilacji azotanów prowadzone są na

roślinach wyższych, grzybach nitkowatych oraz bakteriach.

Asymilacja azotanów u grzybów zachodzi dwuetapowo:

azotany redukowane są do azotynów w reakcji katalizo-

wanej przez reduktazę azotanową, następnie azotyny do

jonów amonowych w reakcji katalizowanej przez reduktazę

azotynową. Reduktaza azotanowa to złożony enzym kata-

lizujący dwuelektronowe przekształcenie azotanów do azo-

tynów, wykorzystujący NAD(P)H jako donor elektronów

oraz zawierający FAD, żelazo hemowe i molibdenopterynę

jako grupy prostetyczne. Reduktaza azotanowa jest czynni-

kiem limitującym wzrost wszystkich organizmów asymi-

lujących azotany. Reduktaza azotynowa katalizuje sześcio-

elektronową redukcję azotynów do jonów amonowych i u

grzybów w tym procesie uczestniczy NAD(P)H. Reduktaza

azotynowa zawiera dwie grupy prostetyczne: centrum żela-

zowo-siarkowe, sirohem i dodatkowo u grzybów i bakterii

FAD [45].

Wiadomo, że wiele gatunków drożdży potrafi asymilo-

wać azotany, jednak do niedawna nie były to organizmy

wykorzystywane do badania tego procesu. Jedynym gatun-

kiem drożdży, który w ostatnich latach stał się obiektem ba-

dań molekularnych mechanizmów asymilacyjnej redukcji

azotanów jest H. polymorpha. Wykazano, że sposób asymi-

lacji azotanów u H. polymorpha jest taki sam, jak u grzybów

nitkowatych Aspergillus nidulans i Neurospora crassa. Wymie-

nione mikroorganizmy potrzebują do tego procesu syntezy

transporterów azotanów, reduktazy azotanowej i azotyno-

wej. Do tego czasu zidentyfikowano u H. polymorpha tylko

jeden gen YNT1, kodujący białko transporterowe o wy-

sokim powinowactwie do azotanów [45]. Białko Ynt1 jest

transporterem azotanów i odgrywa główną rolę w regulacji

asymilacji azotanów z udziałem mechanizmu potranslacyj-

nego. W przypadku braku azotanów powstają koniugaty

Ynt1 z ubikwityną, które szybko ulegają degradacji w wa-

kuolach. Ostatnio wykazano, że delecja centralnej domeny

hydrofilowej białka Ynt1 (zawierającej sekwencję podobną

do PEST) prowadzi do defektu w procesie wchłaniania biał-

ka Ynt1 przez wakuole i jego późniejszej degradacji. Degra-

dacja Ynt1 odbywa się w obecności glutaminy i proces ten

zachodzi niezależnie od represji białka Ynt1, także wywoły-

wanej glutaminą [46].W warunkach deficytu azotu amono-

wego zachodzi fosforylacja białka Ynt1, transportera azota-

nów, która jest niezbędna do indukcji genów metabolizmu

azotanów. Fosforylacja chroni białko Ynt1 przed degradacją

i umożliwia jego włączenie do błony cytoplazmatycznej ko-

mórki. Mechanizmy transportu azotynów, które również

mogą być źródłem azotu u H. polymorpha, nie są do końca

poznane [47].

Pierwszy etap asymilacji azotanów to ich redukcja do

azotynów, katalizowana przez reduktazę azotanową, kodo-

100

www.postepybiochemii.pl

waną u H. polymorpha przez gen YNR1. Białko Ynr1 H. po-

lymorpha wykazuje wysoką homologię do reduktazy azota-

nowej u roślin i innych gatunków grzybów. Reduktaza azo-

tanowa H. polymorpha potrzebuje kilku kofaktorów, m.in.

molibdenopteryny, hemu i FAD. W przeciwieństwie do

transporterów azotanów Ynt1, reduktaza azotynowa Ynr1

H. polymorpha nie jest inaktywowana przez zredukowane

źródła azotu (jony amonu, glutamina). Reduktaza azotyno-

wa u H. polymorpha kodowana jest przez gen YNI1 [48]. Geny

H. polymorpha YNR1, YNI1, YNT1, kodujące odpowiednio

reduktazę azotanową, reduktazę azotynową i białko trans-

porterowe azotanów, tworzą klaster, ale ich transkrypcja

zachodzi niezależnie. Zidentyfikowano również dwa geny

regulatorowe YNA1 i YNA2, kodujące białka należące do

rodziny Zn(II)

Cys

. Mutacje w genach regulatorowych pro-

wadzą do niezdolności do asymilacji azotanów i indukcji

ekspresji genów strukturalnych. Białko Yna1 jest potrzebne

do indukcji białka Yna2, podczas gdy Yna2 nie bierze udzia-

łu w aktywacji transkrypcji Yna1 [49]. Ostatnie badania

wykazały, że u H. polymorpha również Ure2 bierze udział

w azotowej represji katabolicznej, podobnie jak u S.cerevi-

siae. Białko to ulega fosforylacji w obecności preferowanego

źródła azotu oraz defosforylacji w przypadku jego braku.

Ponadto zidentyfikowano również u H. polymorpha czyn-

niki HpGat1, HpGat2 oraz HpGzf3 o znacznym podobień-

stwie do czynników GATA u S. cerevisiae. Prawdopodobnie

HpUre2 funkcjonuje tak jak u S. cerevisiae, pozostawiając

czynniki GATA na zewnątrz jądra komórkowego podczas

wzrostu na podłożu zawierającym preferowane źródła azo-

tu i blokując tym samym ekspresję genów związanych z me-

tabolizmem gorszych źródeł azotu, np. azotanów. Wyniki te

świadczą o tym, że system regulacji metabolizmu azotanów

u drożdży H. polymorpha jest bliższy do S. cerevisiae niż do

grzybów nitkowatych A. nidulans i N. crassa [48].

Na podstawie obecnych danych nie można jednak stwo-

rzyć modelu mechanizmu regulacji ekspresji genów asy-

milacji azotanów w zależności od czynników środowisko-

wych. Z punktu widzenia fizjologii, regulacja syntezy en-

zymów szlaku asymilacji azotanów przedstawia się bardzo

prosto. W celu syntezy białek biorących udział w asymilacji

azotanów, niezbędny jest induktor — azotan. Azotany są

wtórnymi źródłami azotu, podczas gdy jony amonu i glu-

tamina pierwotnymi. W obecności pierwotnych źródeł azo-

tu, enzymy asymilacji azotanów nie powstają, a te istniejące

ulegają degradacji.

H. polymorpha JAKO SYSTEM PRODUKCJI

WŁASNYCH I HETEROLOGICZNYCH BIAŁEK

H. polymorpha, jak przedstawiono wyżej, jest jednym z

dwóch gatunków drożdży metylotroficznych (oprócz P. pa-

storis) wykorzystywanych jako systemy do syntezy białek

heterologicznych (obcych), ale także własnych białek o zna-

czeniu przemysłowym. Do ekspresji używane są stabilne

wektory zdolne do integracji z genomem [3]. Tradycyjnie

do transformacji wykorzystywano koliste plazmidy, zawie-

rające autonomicznie replikujące się sekwencje S. cerevisiae

(ARS) lub H. polymorpha (HARS), które z reguły włączają

się do genomu. Taka integracja może występować w ciągu

wielu generacji, w rezultacie czego mogą powstawać trans-

formanty posiadające nawet do 100 kopii plazmidu integra-

cyjnego w postaci powtórzeń tandemowych [3,18].

Prawdopodobnie, przypadkowa integracja nie zacho-

dzi wskutek częstej rekombinacji sekwencji genetycznych

wektora i genomowego DNA. Przykładowo w przypadku

wykorzystania wektorów z promotorami FMD, MOX, TPS1

(odpowiednio genów dehydrogenazy mrówczanowej, oksy-

dazy alkoholowej i syntazy 6-fosfotrehalozy) rekombinacja

zachodziła w odpowiednich genach chromosomalnych [50].

Jednakże wysokokopijność włączonego wektora nie zawsze

prowadzi do nadprodukcji docelowego białka, zwłaszcza

w przypadku białek sekrecyjnych. Na przykład dla osią-

gnięcia maksymalnej produkcji glukoamylazy Schwannio-

myces occidentalis wystarczającym okazało się wstawienie

tylko czterech kopii odpowiedniego genu wchodzącego w

skład wektora HARS [3]. Maksymalna produkcja urokina-

zowego aktywatora plazminogenu człowieka (u-PA) i albu-

miny surowicy człowieka HSA w szczepie DL-1 osiągnięta

została przez włączenie jednej lub dwóch kopii wektora

ekspresyjnego do genomu [18]. Ukierunkowana integracja

u H. polymorpha wymaga znacznie dłuższych homologicz-

nych sekwencji, niż to opisano dla S. cerevisiae [3]. Wektory,

które niosą zestaw składający się z kilku subtelomerowych

sekwencji ARS okazały się zdolnymi do homologicznej inte-

gracji do genomu, co prowadzi do włączenia pojedynczych

lub wielokrotnych powtórzeń tandemowych do odpowied-

nich telomerowych miejsc genomu [51]. Skonstruowano

zestaw wektorów do włączania heterologicznych sekwencji

do locus rybosomalnego DNA H. polymorpha. Zidentyfiko-

wano również sekwencje rybosomalnego DNA odpowie-

dzialne za optymalną integrację i ekspresję. Sekwencje te

zawarte są w integracyjnych wektorach ekspresji i wchodzą

w skład systemu zwanego Co-Med

[50].

Pichia pastoris JAKO NAJBARDZIEJ POPULARNY

PRODUCENT BIAŁEK HETEROLOGICZNYCH

P. pastoris to jeden z najbardziej popularnych organi-

zmów wykorzystywanych do produkcji białek heterolo-

gicznych. Efekty ostatnich badań wskazują na możliwość

zastosowania drożdżowego systemu ekspresji do syntezy

biofarmaceutyków, jako alternatywy dla bakteryjnych sys-

temów ekspresji z wykorzystaniem E. coli. Spośród różnych

gatunków drożdży metylotroficznych, P. pastoris jest najczę-

ściej używana jako platforma ekspresji [52]. Do 2007 roku u

P. pastoris sklonowano i eksprymowano ponad 600 genów

[53]. W bazie PubMed dla hasła P. pastoris pojawia się 3800

odniesień, podczas gdy dla hasła H. polymopha ukazuje się

zaledwie 600 źródeł. Dla porównania dla S. cerevisiae istnie-

je ponad 98000 odniesień. Jednak zarówno w przypadku P.

pastoris, jak i H. polymorpha większość publikacji dotyczy

heterologicznej produkcji białek, natomiast w przypadku

drożdży piekarskich prac takich jest niewiele. W niedawno

opublikowanych pracach przeglądowych można odnaleźć

metody zarówno genetyki klasycznej jak i molekularnej dla

P. pastoris, niezbędne dla otrzymania mutantów, hybrydy-

zacji, analizy segregacji, konstruowania kaset ekspresyj-

nych i efektywnej produkcji białek heterologicznych [54,55].

Popularność P. pastoris bazuje na kilku zaletach tego

organizmu: prostota manipulacji genetycznych, obecność

efektywnego systemu wektor-gospodarz, w tym, ściśle

regulowanego i silnie indukowanego promotora AOX1

oksydazy alkoholowej, zdolność do tworzenia białek o pra-

widłowej strukturze przestrzennej, w tym tworzenie wiązań

Postępy Biochemii 59 (1) 2013

101

dwusiarczkowych, a także inne potranslacyjne modyfikacje

charakterystyczne dla eukariontów. Wykorzystanie promo-

tora AOX1 do syntezy obcych białek u P. pastoris umożliwia

osiągnięcie wysokiej biomasy (ponad 130 g suchej masy na

litr), prawdopodobnie na skutek niskiego zapotrzebowania

energetycznego podczas wzrostu na metanolu [56]. Zdol-

ność do efektywnej sekrecji białek heterologicznych oraz

niski poziom wydzielania białek endogennych do podłoża

to jeszcze jedna zaleta P. pastoris istotnie ułatwiająca oczysz-

czanie zrekombinowanego produktu [57]. Na drodze inży-

nierii genetycznej skonstruowano także szczepy P. pastoris

ze „zhumanizowanym” sposobem glikozylacji heterolo-

gicznych białek sekrecyjnych, co zwiększa możliwość wy-

korzystania P. pastoris do produkcji biofarmaceutyków [58].

Genom P. pastoris został zsekwencjonowany (http://ergo.

integratadgenomics.com/ERGO/) [57,59], dzięki czemu

możliwe są dalsze udoskonalenia w otrzymywaniu produ-

centów białek z wykorzystaniem metod inżynierii metabo-

licznej i biologii systemowej. Genom P. pastoris o wielko-

ści 9,43 Mb, zawiera 41,1% par zasad GC, a łączna liczba

otwartych ramek odczytu to 5313 [59]. U P. pastoris, po raz

pierwszy u drożdży metylotroficznych, zbadano całkowitą

sekwencję mitochondrialnego DNA. Kolista cząsteczka mi-

tochondrialnego DNA o wielkości 35,7 kbp zawiera 15 ge-

nów kodujących białka, 2 rRNA i 25 tRNA loci [60].

Ze względu na liczne podobieństwa systemów ekspresji

P. pastoris i H. polymorpha porównano ich efektywność bada-

jąc syntezę dwóch heterologicznych białek: fragmentu NK1

(22 kDa) czynnika wzrostu hepatocytów człowieka i dome-

ny zewnątrzkomórkowej (28 kDa) czynnika tkankowego

myszy (MTF). Wykazano istotną przewagę P. pastoris, zwią-

zaną z wyższą biomasą, większą ilością produktu końcowe-

go, oraz mniejszą degradacją eksprymowanych białek he-

terologicznych [61]. Ostatnio eksprymowano również gen

((L1/L2 (ChiΔH-L2) syntezujący białko ludzkiego wirusa

HPV i w tym przypadku także zaobserwowano wyższe stę-

żenie produktu końcowego przy wykorzystaniu systemu

ekspresji P. pastoris w porównaniu do H. polymorpha [62].

Oczywistym jest, że na przykładzie trzech białek nie

można wysuwać dalekosiężnych wniosków, można jednak

stwierdzić, że z użyciem P. pastoris łatwiej i szybciej udaje

się uzyskać efektywnych nadproducentów białek hetero-

logicznych. Ponadto, firma Invitrogen dostarcza zestawy

szczepów tzw. „biorców” (komórek zdolnych do pobrania

egzogennego materiału genetycznego) oraz wektory po-

trzebne do heterologicznej ekspresji u P. pastoris, podczas

gdy nie są one dostępne dla H. polymorpha. Niemniej jed-

nak H. polymorpha ma również swoje zalety. Jak przedsta-

wiono powyżej, drożdże te są bardziej termotolerancyjne,

co pozwala zwiększyć ekonomiczność procesów, wskutek

zmniejszenia kosztów chłodzenia bioreaktorów, a także

produkować białka o bardziej stabilnej strukturze [55,61].

Poza tym, heterologiczną ekspresję u dzikiego szczepu H.

polymorpha i mutanta gcr1 pod kontrolą promotora MOX

można indukować glicerolem, glukozą lub ksylozą, substra-

tami, które w przeciwieństwie do metanolu, nie są toksycz-

ne ani łatwopalne [63].

Pichia methanolica

P. methanolica MH4 jest szczepem haploidalnym, zdol-

nym do diploidyzacji. Diploidalne komórki mogą roz-

mnażać się wegetatywnie przez dłuższy czas na podłożu

minimalnym. Po przeniesieniu komórek do podłoża Rg

ułatwiającego sporulację zachodzi obfita sporulacja, w wy-

niku której powstaje do 90% worków ze sporami, z których

większość zawiera po 4 zarodniki. Wegetatywne komór-

ki diploidalne mogą segregować chromosomy w wyniku

spontanicznej haploidyzacji. Proces ten indukowany jest

promieniowaniem γ i w optymalnych warunkach, do 10%

komórek przekształca się w aneuploidy. Powstałe aneuplo-

idy tworzą wolno rosnące kolonie. Cecha ta ułatwia identy-

fikację aneuploidów i może być wykorzystywana do lokali-

zacji markerów na chromosomach [54].

CHROMOSOMY, GENY I MARKERY GENETYCZNE

Elektroforeza pulsacyjna w systemie CHEF (Countour-

Сlamped Homogenous Electrophoresis Field) umożliwiła u

szczepów P. methanolica MH4 i NRRL Y-7685 identyfikację 4

fragmentów

DNA o rozmiarach 6; 4,2; 3,6 i 3,1 Mb. Mutanty

auksotroficzne izolowane ze szczepów MH4 i NRRL Y-7685

łatwo się krzyżują, a powstające diploidy obficie sporulują

na podłożu Rg tworząc worki zawierające przeważnie po 4

spory. Grupy genów sprzężonych u P. methanolica zidentyfi-

kowano za pomocą analizy tetrad i indukowanej haploidy-

zacji. Mapowanie za pomocą analizy tetrad wykonano dla

około 30 markerów (mutacje auksotroficzne, mutacje locus,

mutacje uszkadzające utylizację związków jedno i dwuwę-

glowych). W rezultacie zidentyfikowano 4 centromery, co

odpowiada czterem chromosomom i jednemu fragmentowi

chromosomowemu, prawdopodobnie dystalnej części jed-

nego z chromosomów [64]. Uzyskane tym sposobem dane

mapowania genetycznego dobrze korelują z wynikami

elektroforezy pulsacyjnej [54]. Mapę genetyczną P. methano-

lica przedstawiono na Ryc. 2.

GENETYCZNA KONTROLA METABOLIZMU METANOLU

U P. methanolica występują takie same enzymy metabo-

lizmu metanolu, jak i u innych drożdży metylotroficznych

Rycina 2. Mapa genetyczna drożdży Pichia methanolica MH4. Linie ciągłe — po-

łożenie genów określone na podstawie analizy tetrad; linie przerywane — okre-

ślone na podstawie haploidyzacji indukowanej; koła — oznaczają centromery.

102

www.postepybiochemii.pl

[2,65,66]. Istnieje ogólny pogląd, że energia potrzebna do

wzrostu metylotroficznego powstaje wyłącznie w szla-

ku utleniania formaldehydu do CO

w rekacjach katalizo-

wanych przez dehydrogenazę formaldehydu zależną od

NAD i GSH oraz dehydrogenazę mrówczanową zależną od

NAD [6]. Dane te nie są zgodne z szeregiem spostrzeżeń

dokonanych u P. methanolica i H. polymorpha. Wykazano, że

2-fluorooctan hamuje wzrost dzikiego szczepu P. methanoli-

ca, a malonian (inhibitor dehydrogenazy bursztynianowej)

blokuje wzrost mutanta P. methanolica icl1 z defektem lia-

zy izocytrynianowej na podłożu agarowym z metanolem,

etanolem i glicerolem, ale nie z glukozą. Stwierdzono, że

zdolność malonianu do hamowania wzrostu na podłożu

z metanolem zależy od obecności markera icl1. Uzyska-

no również mutanty H. polymorpha z całkowitym brakiem

aktywności dehydrogenaz formaldehydu i mrówczanu i

wykazano, że mutanty te są zdolne do wzrostu w hodowli

ciągłej z metanolem jako jedynym źródłem węgla i energii.

Powyższe obserwacje pozwalają na wysnucie hipotezy, że

energia potrzebna do wzrostu drożdży metylotroficznych

pochodzi głównie z asymilacji formaldehydu w szlaku ksy-

lulozomonofosforanowym oraz w cyklu kwasów trójkar-

boksylowych [64].

Wiadomo, że metanol silnie indukuje syntezę enzymów

katabolizmu metanolu, a glukoza i etanol to korepresory

tego procesu, powodujące również kataboliczną inaktywa-

cję białek peroksysomalnych metabolizmu metanolu wsku-

tek autofagicznej degradacji peroksysomów (peksofagii)

[27]. Drożdże P. methanolica stały się obiektem badań nie-

których aspektów regulacji metabolizmu metylotroficzne-

go. Analizowano następujące problemy:

• identyfikację intermediatów katabolizmu etanolu, powo-

dujących represję kataboliczną oraz autofagiczną degra-

dację enzymów metabolizmu metanolu,

• identyfikację genów kontrolujących represję katabolicz-

ną.

IDENTYFIKACJA INTERMEDIATóW

KATABOLIZMU ETANOLU POWODUJąCYCH

REPRESJĘ KATABOLICZNą I INAKTYWACJĘ

ENZYMóW SZLAKU METYLOTROFICZNEGO

W celu identyfikacji intermediatów metabolizmu etanolu

uzyskano mutanty P. methanolica z defektem poszczegól-

nych etapów katabolizmu tego dwuwęglowego substratu.

Izolowano mutanty P. methanolica niezdolne do wzrostu na

podłożu z etanolem jako jedynym źródłem węgla. Wszyst-

kie 24 mutanty okazały się także niezdolne do wzrostu na

podłożu z octanem, a jednocześnie wzrost na podłożu z me-

tanolem i substratami wielowęglowymi zachodził normal-

nie. Mutacje te były recesywne i podzielono je na 4 grupy

komplementacji. U przedstawicieli poszczególnych grup

komplementacji zaobserwowano brak aktywności specy-

ficznych enzymów metabolizmu związków dwuwęglo-

wych: liazy izocytrynianowej, syntazy jabłczanowej, kar-

boksykinazy fosfoenolopirogronianowej i dehydrogenazy

jabłczanowej. Otrzymane mutacje opisano odpowiednio

jako: icl1, mls1, pck1, mdd1 [64].

W innej serii badań wyizolowano z kolei 106 mutantów

opornych na 2-fluorooctan, niezdolnych do utylizacji etano-

lu i octanu jako jedynych źródeł węgla. Mutacje te okazały

się recesywnymi i podzielono je na 3 grupy komplementa-

cji. U przedstawicieli każdej z grup wykazano brak aktyw-

ności syntazy acetylo-CoA. Mutacje oznaczono jako: acs1,

acs2, acs3. Nie znaleziono jednak żadnego sprzężenia mię-

dzy mutacjami tych grup komplementacji [67].

Spośród mutantów P. methanolica opornych na alkohol

allilowy zidentyfikowano szczepy z obniżoną 30-40-krotnie

aktywnością dehydrogenazy alkoholowej. Mutacja ta była

recesywna, monogenowa i oznaczono ją jako adh1. Z tego

szczepu izolowano podwójnego mutanta oznakowanego

jako adh1 adh2 z całkowitym brakiem aktywności dehydro-

genazy alkoholowej [7]. Ponadto wyizolowano mutanta

aldX zdolnego do wzrostu na podłożu z octanem, ale nie

etanolem jako jedynym źródłem węgla [64].

Badania nad wpływem etanolu i octanu na represję i in-

aktywację oksydazy alkoholowej i katalazy u mutantów i

dzikich szczepów P. methanolica wykazały, że octan jest

bezpośrednim efektorem (korepresorem) wywołującym

represję kataboliczną enzymów metabolizmu związków

jednowęglowych w podłożu z etanolem, natomiast bezpo-

średnim efektorem katabolicznej inaktywacji enzymów pe-

roksysomalnych indukowanych etanolem jest kwas gliok-

salowy [7].

IDENTYFIKACJA GENóW BIORąCYCH

UDZIAŁ W REPRESJI KATABOLICZNEJ

Hodowla na podożu z metanolem pozwoliła na wyizolo-

wanie mutantów P. methanolica opornych na 2-deoksyglu-

kozę (niemetabolizowany analog glukozy), u których zo-

stała uszkodzona represja kataboliczna. Analiza genetyczna

umożliwiła ich podział na 4 grupy: gcr1, gcr2 (mutacje rece-

sywne), GCR3

i GCR4

(mutacje dominujące). Zakłada się,

że geny GCR1 i GCR2 działają jako negatywne, natomiast

geny GCR3 i GCR4, jak pozytywne regulatory syntezy en-

zymów metabolizmu metanolu. Część zidentyfikowanych

mutacji prowadziła do uszkodzenia tylko represji katabo-

licznej, dlatego do syntezy enzymów szlaku metylotroficz-

nego potrzebny był induktor (metanol), podczas gdy inne

mutacje powodowały konstytutywną syntezę enzymów

metabolizmu metanolu w podłożu z glukozą bez induktora.

Etanol i glukoza powodowały represję syntezy tych enzy-

mów u wszystkich zbadanych mutantów [64,66,68].

W celu izolacji mutantów P. methanolica z defektem re-

presji katabolicznej indukowanej etanolem wykorzystano

następujące podejście: etanol powoduje represję syntezy

oksydazy alkoholowej u mutanta icl1 pozbawionego liazy

izocytrynianowej, dlatego mutant ten nie rośnie na podło-

żu z mieszaniną metanolu i etanolu. Wyizolowano mutanty

icl1 zdolne do wzrostu na mieszaninie tych dwóch alkoholi.

Zidentyfikowano u nich recesywną, monogenową mutację

oznaczoną jako ecr1. Glukozowa represja kataboliczna u

tych mutantów nie była uszkodzona. Inaktywacja katabo-

liczna oksydazy alkoholowej i katalazy w podłożu z etano-

lem także nie była zaburzona [64,66]. Represja etanolowa

była naruszona także u mutantów adh1 charakteryzująych

się 30-40 –krotnie obniżoną aktywnością dehydrogenazy al-

koholowej. Represja glukozowa u tych mutantów działała

prawidłowo [7].

Postępy Biochemii 59 (1) 2013

103

Wpływ różnych źródeł węgla na syntezę oksydazy alko-

holowej badano u dzikiego szczepu oraz u mutantów gcr1

(defekt glukozowej represji katabolicznej), oraz ecr1 (defekt

etanolowej represji katabolicznej). Substraty węglowe po-

wodujące represję syntezy oksydazy alkoholowej podzielo-

no na 4 grupy. Heksozy i ksyloza tworzą pierwszą grupę, w

której represujące działanie tych cukrów naruszone jest tyl-

ko u mutanta gcr1. Represja przez substraty (etanol, octan,

2-oksoglutaran) należące do drugiej grupy naruszona była

tylko u mutanta ecr1. Represja przez trzecią grupę, do któ-

rych należy malonian i dihydroksyaceton nie została osła-

biona u obu mutantów gcr1 i ecr1. Do czwartej grupy należą

związki (L-arabinoza, sorbitol, xylitol, celobioza), których

działanie represyjne było częściowo osłabione u mutantów

obu grup. Wyciągnięto wniosek o istnieniu u P. methanolica

niezależnych mechanizmów represji katabolicznej zależ-

nych od natury korepresora (substratu węglowego) [64].

Na podstawie analizy biochemicznej mutantów gcr1,

gcr2, GCR2c, GCR4c i ecr1 wykazano, że fosfofruktokinaza i

dehydrogenaza 2-oksoglutaranu uczestniczą odpowiednio

w glukozowej i etanolowej represji katabolicznej. Otrzyma-

ne dane świadczą także o różnicach genetycznych pomię-

dzy mechanizmami represji katabolicznej i inaktywacji ka-

tabolicznej (peksofagia) enzymów metabolizmu metanolu

[66].

Szczegółowe badania właściwości mutanta ecr1 z zabu-

rzoną etanolową represją kataboliczną, nieoczekiwanie wy-

kazały, że u tego mutanta, w przeciwieństwie do szczepu

dzikiego, metanol powoduje prawie całkowity blok syntezy

indukowanych etanolem glioksysomowych enzymów me-

tabolizmu dwuwęglowego, liazy izocytrynianowej i synta-

zy jabłczanowej. Podczas hodowli mutanta ecr1 i dzikiego

szczepu na podłożu z mieszaniną metanolu i etanolu zaob-

serwowano wzrost diauksyczny. Szczep dziki najpierw me-

tabolizował etanol i syntetyzował enzymy glioksysomalne

biorące udział w metabolizmie substratów dwuwęglowych,

podczas gdy mutant ecr1 najpierw metabolizował metanol

i syntetyzował peroksysomalne enzymy biorące udział w

metabolizmie związków jednowęglowych. Przypuszczono,

że kolejność metabolizmu metanolu i etanolu w mieszaninie

tych związków i syntezy odpowiednich enzymów zależy

od allelicznego stanu genu regulatorowego ECR1. Obecność

dzikiego allelu warunkuje w pierwszej kolejności biogenezę

mikrociał glioksysomów, podczas gdy u mutanta ecr1 pe-

roksysomów. Mechanizm działania genu ECR1 pozostaje

niewyjaśniony. W przeciwieństwie do ecr1, mutacja adh1

(obniżona aktywność dehydrogenazy alkoholowej) umoż-

liwia jednoczesną obecność w komórkach enzymów me-

tabolizmu substratów jedno i dwuwęglowych, dlatego też

wzrost mutanta adh1 na podłożu zawierajacym mieszaninę

etanolu i metanolu zachodzi bez diauksji. Komórki mutan-

ta, rosnące na podłożu z etanolem, posiadały hybrydowe

mikrociała, glioksyperoksysomy, zawierające jednocześnie

oksydazę alkoholową i syntazę jabłczanową, co umożliwia-

ło jednoczesną utylizację etanolu i metanolu [67].

Jak widać, P. methanolica posiada skomplikowany system

regulacji represji katabolicznej podczas wzrostu na pod-

łożach zawierających różne substraty węglowe, w której

uczestniczy kilka genów regulatorowych o zróżnicowanych

funkcjach.

U P. methanolica odkryto nowe zjawisko metanolowej

katabolicznej inaktywacji enzymów metabolizmu sub-

stratów dwuwęglowych (liazy izocytrynianowej, syntazy

bursztynianowej, dehydrogenazy alkoholowej, dehydroge-

nazy aldehydu octowego). Dodanie metanolu do hodowli

komórek w podłożu z etanolem powodowało gwałtowny

spadek aktywności powyższych enzymów. Pełna inakty-

wacja następowała po 5-7 godzinach po dodaniu metanolu.

Formaldehyd i mrówczan także powodował inaktywację

enzymów katabolizmu etanolu. Mieszanina etanolu i meta-

nolu nie powodowała inaktywacji liazy izocytrynianowej i

dehydrogenazy alkoholowej u dzikiego szczepu, natomiast

efektywnie inaktywowała te enzymy u mutanta ecr1 z de-

fektem etanolowej represji katabolicznej. Prawdopodobnie

rozpoczęcie procesu rozkładu metanolu jest niezbędne do

zainicjowania inaktywacji enzymów metabolizmu dwuwę-

glowych substratów[64].

KONTROLA GENETYCZNA SYNTEZY

ENZYMóW METABOLIZMU METANOLU

P. methanolica posiada dwa geny kodujące oksydazę

alkoholową, MOD1 i MOD2. Oba produkty tych genów

przypadkowo ze sobą asocjują tworząc aktywny oktamer,

co prowadzi do powstania 9 różnych izozymów oksydazy

alkoholowej [69]. Na podstawie ekspresji heterologicznego

genu kwaśnej fosfatazy drożdży piekarskich S. cerevisiae

badano właściwości regulacji ekspresji promotorów genów

MOD1 i MOD2. Promotor MOD1 indukowany był nie tyl-

ko w podłożu z metanolem ale także z glicerolem, podczas

gdy promotor MOD2 indukowany był tylko przez metanol,

natomiast dodanie glicerolu do podłoża z metanolem nie

powodowało jego represji. Promotor MOD1 najefektyw-

niej był indukowany przy niskim stężeniu metanolu, a pro-

motor MOD2, przy wysokich stężeniach metanolu i tlenu.

Świadczy to o tym, że ekspresja obu promotorów oksydazy

alkoholowej regulowana jest w zupełnie inny sposób. Wy-

kazane różnice pozwalają na wykorzystanie promotorów

genów MOD1 i MOD2 do kontroli ekspresji genów hetero-

logicznych u P. methanolica, a nawet do jednoczesnej regu-

lacji syntezy dwóch różnych białek heterologicznych [70].

Katalaza, zlokalizowana w peroksysomach, kodowana jest

przez gen CTA1 [71]. Niedawno odkryto dwa geny DAS1

i DLP1 o wysokim podobieństwie do syntazy dihydroksy-

acetonu (DAS), peroksysomalnego enzymu metabolizmu

metanolu. Heterologiczna ekspresja genu DAS1 u mutanta

Candida boidinii das1 przywracała zdolność do utylizacji me-

tanolu, podczas gdy ekspresja genu DLP1 nie. Na tej pod-

stawie stwierdzono, że gen DAS1 koduje syntazę dihydrok-

syacetonu u P. methanolica, natomiast funkcje genu DLP1 nie

są jeszcze poznane [72]. P. methanolica posiada tylko po jed-

nym genie strukturalnym dehydrogenazy formaldehydu i

mrówczanu [8].

Candida boidinii

Candida boidinii to asporogenny gatunek drożdży me-

tylotroficznych. Podobnie do innych gatunków drożdży

metylotroficznych, C. boidinii wykorzystywana jest do kon-

struowania producentów białek heterologicznych. Sposób

104

www.postepybiochemii.pl

regulacji promotora oksydazy alkoholowej C. boidinii AOD1

różni się od H. polymorpha i przypomina P. pastoris: maksy-

malna ekspresja genu AOD1 wymaga jednoczesnej derepre-

sji glukozowej (braku glukozy lub obecności glicerolu, ole-

inianu w podłożu) oraz indukcji metanolem (występowania

metanolu w podłożu). Oprócz promotora AOD1, sklonowa-

no i scharakteryzowano 5 innych promotorów regulowa-

nych metanolem, wśród których najbardziej silnym okazał

się promotor genu syntazy dihydroksyacetonu DAS1. W

odróżnieniu od promotora AOD1, który częściowo ulega

derepresji w podłożu z glicerolem lub oleinianem, promo-

tor syntazy dihydroksyacetonu DAS1 nie wykazuje wcale

derepresji w podłożu z alternatywnymi źródłami węgla bez

metanolu i jego ekspresja zachodzi tylko i wyłącznie w pod-

łożu z metanolem, jako induktorem [31]. Jak już wspomina-

no wyżej, u H. polymorpha i P. pastoris, w indukcji ekspresji

genów kodujących enzymy metabolizmu metanolu uczest-

niczą czynniki transkrypcyjne Mpp1p i Mxr1p [29,30].

Metodę mutagenezy insercyjnej wykorzystano do poszu-

kiwania odpowiednich genów regulatorowych u C. boidi-

nii. W wyniku tego zidentyfikowano i scharakteryzowano

nowy czynnik transkrypcyjny Trm1p. Białko to należy do

klasteru Zn(II)

Cys

, do którego należy wiele regulatorów

transkrypcyjnych różnych grzybów. Delecja TRM1 całkowi-

cie blokuje wzrost na metanolu, ale nie wpływa na wzrost

na substratach poliwęglowych (glukoza, glicerol, etanol,

oleinian), co świadczy o specyficznej roli białka Trm1p w

regulacji indukcji przez metanol, a nie derepresji glukozą.

Ponadto aktywność transkrypcyjna wszystkich indukowa-

nych przez promotor genów u szczepu trm1 jest całkowi-

cie zahamowana, co świadczy o decydującej roli Trm1p w

regulacji ekspresji genów metabolizmu metanolu u C. bo-

idinii. W promotorze DAS1 odkryto dwa elementy MRE1 i

MRE2 (methanol response elements). Przypuszczalnie czynnik

transkrypcyjny Trm1p jest niezbędny dla zależnej od MRE1

indukcji DAS1 przez metanol. Analiza immunoprecypitacji

chromatyny wykazała, że Trm1p wiąże się z pięcioma indu-

kowanymi przez metanol promotorami prawdopodobnie

przy pomocy dodatkowego, na razie nie zidentyfikowane-

go, białka. Takim białkiem może być homolog H. polymor-

pha Mpp1p, którego do tej pory nie zidentyfikowano u C.

boidinii [31].

U C. boidinii zidentyfikowano jeszcze jeden gen regula-

torowy, oznaczony jako TRM2. Białko Trm2p zawiera dwa

motywy cynkowych palców typu C2H2 na N końcu i wy-

kazuje wysoką homologię z wcześniej zidentyfikowanymi

czynnikami traksrypcyjnymi Mxr1p u P. pastoris i Adr1p u

S. cerevisiae. Trm2p specyficznie wiąże się z promotorami

genów AOD1 i DAS1 w komórkach rosnących na podłożu

z metanolem lub oleinianem, ale nie przyłącza się do tych

promotorów w komórkach rosnących na podłożu z gluko-

zą. W komórkach rosnących na podłożu z metanolem biał-

ko to zlokalizowane jest w jądrze komórkowym, natomiast

na podłożu z glukozą w cytoplazmie. Mutant trm2 nie rósł

na podłożu z metanolem i oleinianem, natomiast rósł na

podłożu z glukozą i etanolem. Białko Trm2 jest niezbędne

do aktywacji genów indukowanych metanolem [1]. Ziden-

tyfikowano również gen MIG1 kodujący białko homologicz-

ne do represora glukozy Mig1p u S. cerevisiae i wykazano,

że białko to uczestniczy w negatywnej regulacji ekspresji

genów indukowanych metanolem [73].

Na podstawie badań C. boidinii, skonstruowano wielu

producentów heterologicznych i własnych białek cytoso-

lowych (aktynaza adenylowa, α-аntytrypsyna), peroksyso-

mowych (oksydaza kwasów tłuszczowych, oksydaza sper-

midyny, oksydaza D-aminokwasów) i sekrecyjnych (gluko-

amylaza, fitaza, katepsyna C i transglutaminaza) [74].

PODSUMOWANIE

Reasumując, można stwierdzić, że w ciągu ostatnich

dziesięcioleci udało się zbadać główne aspekty regula-

cji metabolizmu metanolu u drożdży metylotroficznych,

szczególnie na poziomie molekularno-genetycznym. Or-

ganizmy te stały się również ulubionym obiektem badań

biologii komórki, zwłaszcza procesów biogenezy i degra-

dacji peroksysomów. Drożdże te posłużyły do sklonowania

silnych regulatorowych i konstytutywnych promotorów,

jak również do skonstruowania efektywnych producentów

zrekombinowanych białek. Drożdże metylotroficzne pozo-

staną więc organizmami o dużym znaczeniu w badaniach z

zakresu biologii komórki oraz biotechnologii.

PIŚMIENNICTWO

1. Sasano Y, Yurimoto H, Kuriyama M, Sakai Y (2010) Trm2p-dependent

derepression is essential for methanol-specific gene activation in the

methylotrophic yeast Candida boidinii. FEMS Yeast Res 10: 535-544

2. Sibirny AA, Titorenko VI, Gonchar MV, Ubiyvovk VM, Kshemin-

skaya GP, Vitvitskaya OP (1988) Genetic control of methanol utiliza-

tion in yeasts. J Basic Microbiol 28: 293-319

3. Gellissen G (2002) Hansenula polymorpha — biology and applications.

Wiley — VCH, Weinheim

4. Horiguchi H, Yurimoto H, Kato N, Sakai Y (2001) Antioxidant system

within yeast peroxisome. Biochemical and physiological characteriza-

tion of CbPmp20 in the methylotrophic yeast Candida boidinii. J Biol

Chem 276: 14279-14288

5. Yurimoto H, Sakai Y, Kato N (2002) Methanol metabolism. W: Gellis-

sen G (red) Hansenula polymorpha — biology and applications. Wiley-

VCH, Weinheim, Germany, str. 61-75

6. Lee B, Yurimoto H, Sakai Y, Kato N (2002) Physiological role of the

glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase in the methylo-

trophic yeast Candida boidinii. Microbiol 148: 2697-2704

7. Sibirny AA, Ubiyvovk VM, Gonchar MV, Titorenko VI, Voronovsky

AY, Kapultsevich YG, Bliznik KM (1990) Reactions of direct formal-

dehyde oxidation to CO2 are non-essential for energy supply of yeast

methylotrophic growth. Arch Microbiol 154: 566-575

8. Nakagawa T, Ito T, Fujimura S, Chikui M, Mizumura T, Miyaji T,

Yurimoto H, Kato N, Sakai Y, Tomizuka N (2004) Molecular charac-

terization of the glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase

gene FLD1 from the methylotrophic yeast Pichia methanolica. Yeast 21:

445-453

9. Veenhuis M, van Dijken JP, Harder W (1983) The significance of per-

oxisomes in the metabolism of one-carbon compounds in yeasts. Adv

Microb Physiol 24: 1-82

10. Ishchuk OP, Voronovsky AY, Abbas CA, Sibirny AA (2009) Construc-

tion of Hansenula polymorpha strains with improved thermotolerance.

Biotechnol Bioeng 104: 911-919

11. Dmytruk OV, Dmytruk KV, Abbas CA, Voronovsky AY, Sibirny AA

(2008) Engineering of xylose reductase and overexpression of xylitol

dehydrogenase and xylulokinase improves xylose alcoholic fermen-

tation in the thermotolerant yeast Hansenula polymorpha. Microb Cell

Fact 7: 21

12. Hong WK, Kim CH, Heo SY, Luo LH, Oh BR, Seo JW (2010) Enhanced

production of ethanol from glycerol by engineered Hansenula polymor-

pha expressing pyruvate decarboxylase and aldehyde dehydrogenase

genes from Zymomonas mobilis. Biotechnol Lett 32: 1077-1082

Postępy Biochemii 59 (1) 2013

105

13. Ubiyvovk VM, Ananin VM, Malyshev AY, Kang HA, Sibirny AA

(2011) Optimization of glutathione production in batch and fed-batch

cultures by the wild-type and recombinant strains of the methylotro-

phic yeast Hansenula polymorpha DL-1. BMC Biotechnol 11: 8

14. Lahtchev KL, Semenova VD, Tolstorukov II, van der Klei I, Veenhuis

M (2002) Isolation and properties of genetically defined strains of the

methylotrophic yeast Hansenula polymorpha CBS4732. Arch Microbiol

177: 150-158

15. Kunze G, Kang HA, Gellissen G (2009) Hansenula polymorpha (Pichia

angusta) Biology and Applications, W: Satyanarayana T, Kunze G (red)

Yeast Biotechnology: Diversity and Applications, Springer, str. 47-64

16. Kurtzman CP, Fell JW (1998) The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th edn.

Elsevier Science, Amsterdam

17. Suh SO, Zhou JJ (2010) Methylotrophic yeasts near Ogataea (Hansenu-

la) polymorpha: a proposal of Ogataea angusta comb. nov. and Candida

parapolymorpha sp. nov. FEMS Yeast Res 10: 631-638

18. Kang HA, Kang W, Hong WK, Kim MW, Kim JY, Sohn JH, Choi ES,

Choe KB, Rhee SK (2001) Development of expression systems for the

production of recombinant human serum albumin using the MOX

promoter in Hansenula polymorpha DL-1. Biotechnol Bioeng 76: 175-185

19. Merckelbach A, Gödecke S, Janowicz ZA, Hollenberg CP (1993) Clon-

ing and sequencing of the ura3 locus of the methylotrophic yeast Han-

senula polymorpha and its use for the generation of a deletion by gene

replacement. Appl Microbiol Biotechnol 40: 361-364

20. Voronovsky AY, Ryabova OB, Verba OV, Ishchuk OP, Dmytruk KV,

Sibirny AA (2005) Expression of xylA genes encoding xylose isomeras-

es from Escherichia coli and Streptomyces coelicolor in the methylotrophic

yeast Hansenula polymorpha. FEMS Yeast Res 5: 1055-1062

21. Tikhomirova LP, Ikonomova RN, Kuznetsova EN (1986) Evidence for

autonomous replication and stabilization of recombinant plasmids in

the transformants of yeast Hansenula polymorpha. Curr Genet 10: 741-

747

22. Faber KN, Haima P, Harder W, Veenhuis M, AB G (1994) Highly-ef-

ficient electrotransformation of the yeast Hansenula polymorpha. Curr

Genet 25: 305-310

23. Ramezani-Rad M, Hollenberg CP, Lauber J, Wedler H, Griess E, Wag-

ner C, Albermann K, Hani J, Piontek M, Dahlems U, Gellissen G (2003)

The Hansenula polymorpha (strain CBS4732) genome sequencing and

analysis. FEMS Yeast Res 4: 207-215

24. Marri L, Rossolini GM, Satta G (1993) Chromosome polymorphisms

among іtrains of Hansenula polymorpha (syn. Pichia angusta). Appl En-

viron Microbiol 59: 939-941

25. Park JN, Sohn MJ, Oh DB, Kwon O, Rhee SK, Hur CG, Lee SY, Gellis-

sen G, Kang HA (2007) Identification of the cadmium-inducible Han-

senula polymorpha SEO1 gene promoter by transcriptome analysis and

its application to whole-cell heavy-metal detection systems. Appl En-

viron Microbiol 73: 5990-6000

26. van der Klei IJ, Yurimoto H, Sakai Y, Veenhuis M (2006) The sig-

nificance of peroxisomes in methanol metabolism in methylotrophic

yeast. Biochim Biophys Acta 1763: 1453-1462

27. Dunn WA Jr, Cregg JM, Kiel JA, van der Klei IJ, Oku M, Sakai Y, Si-

birny AA, Stasyk OV, Veenhuis M (2005) Pexophagy: the selective au-

tophagy of peroxisomes. Autophagy 1: 75-83

28. van Zutphen T, Baerends RJ, Susanna KA, de Jong A, Kuipers OP,

Veenhuis M, van der Klei IJ (2010) Adaptation of Hansenula polymorpha

to methanol: a transcriptome analysis. BMC Genomics 11: 1

29. Leao-Helder AN, Krikken AM, van der Klei IJ, Kiel JA, Veenhuis M

(2003) Transcriptional down-regulation of peroxisome numbers af-

fects selective peroxisome degradation in Hansenula polymorpha. J Biol

Chem 278: 40749-40756

30. Lin-Cereghino GP, Godfrey L, de la Cruz BJ, Johnson S, Khuongsath-

iene S, Tolstorukov I, Yan M, Lin-Cereghino J, Veenhuis M, Subramani

S, Cregg JM (2006) Mxr1p, a key regulator of the methanol utilization

pathway and peroxisomal genes in Pichia pastoris. Mol Cell Biol 26:

883-897

31. Yurimoto H (2009) Molecular basis of methanol-inducible gene ex-

pression and its applications in the methylotrophic yeast Candida boidi-

nii. Biosci Biotechnol Biochem 73: 793-800

32. Gancedo JM (2008) The early steps of glucose signalling in yeast. FEMS

Microbiol Rev 32: 673-704

33. Turcotte B, Liang XB, Robert F, Soontorngun N (2010) Transcriptional

regulation of nonfermentable carbon utilization in budding yeast.

FEMS Yeast Res 10: 2-13

34. Liiv L, Pärn P, Alamäe T (2001) Cloning of maltase gene from a methy-

lotrophic yeast, Hansenula polymorpha. Gene 265: 77-85

35. Alamae T, Pärn P, Viigand K, Karp H (2003) Regulation of the Han-

senula polymorpha maltase gene promoter in H. polymorpha and Saccha-

romyces cerevisiae1. FEMS Yeast Res 4: 165-173

36. Hodgkins M, Mead D, Ballance DJ, Goodey A, Sudbery P (1993) Ex-

pression of the glucose oxidase gene from Aspergillus niger in Han-

senula polymorpha and its use as a reporter gene to isolate regulatory

mutations. Yeast 9: 625-635

37. Parpinello Parpinello G, Berardi E, Strabbioli R (1998) A regulatory

mutant of Hansenula polymorpha exhibiting methanol utilization me-

tabolism and peroxisome proliferation in glucose. J Bacteriol 180: 2958-

2967

38. Alamae T, Liiv L (1998) Glucose repression of maltase and methanol-

oxidizing enzymes in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha:

isolation and study of regulatory mutants. Folia Microbiol 43: 443-452

39. Stasyk OV, Stasyk OG, Komduur J, Veenhuis M, Cregg JM, Sibirny

AA (2004) A hexose transporter homologue controls glucose repres-

sion in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. J Biol Chem

279: 8116-8125

40. Kramarenko T, Karp H, Järviste A, Alamäe T (2000) Sugar repression

in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha studied by using

hexokinase-negative, glucokinase-negative and double kinase-nega-

tive mutants. Folia Microbiol 45: 521-529

41. Laht S, Karp H, Kotka P, Järviste A, Alamäe T (2002) Cloning and

characterization of glucokinase from a methylotrophic yeast Hansenu-

la polymorpha: different effects on glucose repression in H. polymorpha

and Saccharomyces cerevisiae. Gene 296: 195-203

42. Karp H, Järviste A, Kriegel TM, Alamäe T (2003) Cloning and bio-

chemical characterization of hexokinase from the methylotrophic

yeast Hansenula polymorpha. Curr Genet 44: 268-276

43. Stasyk OG, Maidan MM, Stasyk OV, Van Dijck P, Thevelein JM, Si-

birny AA (2008) Identification of hexose transporter-like sensor HXS1

and functional hexose transporter HXT1 in the methylotrophic yeast

Hansenula polymorpha. Eukaryot Cell 7: 735-746

44. Stasyk OG, van Zutphen T, Kang HA, Stasyk OV, Veenhuis M, Sibirny

AA (2007) The role of Hansenula polymorpha MIG1 homologues in ca-

tabolite repression and pexophagy. FEMS Yeast Res 7: 1103-1113

45. Siverio JM (2002) Assimilation of nitrate by yeasts. FEMS Microbiol

Rev 26: 277-284

46. Navarro FJ, Machín F, Martín Y, Siverio JM (2006) Down-regulation

of eukaryotic nitrate transporter by nitrogen-dependent ubiquitinyl-

ation. J Biol Chem 281: 13268-13274

47. Navarro FJ, Martín Y, Siverio JM (2008) Phosphorylation of the yeast

nitrate transporter Ynt1 is essential for delivery to the plasma mem-

brane during nitrogen limitation. J Biol Chem 283: 31208-31217

48. Rodriguez C, Tejera P, Medina B, Guillen R, Dominguez A, Ramos

J, Siverio JM (2010) Ure2 is involved in nitrogen catabolite repression

and salt tolerance via Ca

homeostasis and calcineurin activation in

the yeast Hansenula polymorpha. J Biol Chem 285: 37551-37560

49. Avila J, González C, Brito N, Machín F, Pérez MD, Siverio JM (2002)

A second Zn(II)(2)Cys(6) transcriptional factor encoded by the YNA2

gene is indispensable for the transcriptional activation of the genes in-

volved in nitrate assimilation in the yeast Hansenula polymorpha. Yeast

19: 537-544

50. Steinborn G, Kunze G, Gellissen G (2009) A wide-range integrative

expression vector (CoMed) system for yeasts, W: Satyanarayana T,

Kunze G (red) Yeast Biotechnology: Diversity and Applications. Sprin-

ger, str. 357-368

51. Kim SY, Sohn JH, Bae JH, Pyun YR, Agaphonov MO, Ter-Avanesyan

MD, Choi ES (2003) Eficient library construction by in vivo recombina-

106

www.postepybiochemii.pl

tion with a telomere-originated autonomously replicating sequence of

Hansenula polymorpha. Appl Environ Microbiol 69: 4448-4454

52. Bollok M, Resina D, Valero F, Ferrer P (2009) Recent patents on the Pi-

chia pastoris expression system: expanding the toolbox for recombinant

protein production. Recent Pat Biotechnol 3: 192-201

53. Zhang AL, Luo JX, Zhang TY, Pan YW, Tan YH, Fu CY, Tu FZ (2009)

Recent advances on the GAP promoter derived expression system of

Pichia pastoris. Mol Biol Rep 36: 1611-1619

54. Tolstorukov I, Cregg JM (2007) Classical Genetics, W: Cregg JM (red)

Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa NJ, 389: str.

189-201

55. Cregg JM, Tolstorukov I, Kusari A, Sunga J, Madden K, Chappell T

(2008) Expression in the yeast Pichia pastoris. Methods Enzymol 463:

169-189

56. Jahic M, Veide A, Charoenrat T, Teeri T, Enfors SO (2006) Process tech-

nology for production and recovery of heterologous proteins with Pi-

chia pastoris. Biotechnol Prog 22: 1465-1473

57. De Schutter K, Lin YC, Tiels P, Van Hecke A, Glinka S, Weber-Leh-

mann J, Rouzé P, Van de Peer Y, Callewaert N (2009) Genome sequ-

ence of the recombinant protein production host Pichia pastoris. Nat

Biotechnol 27: 561-566

58. Hamilton SR, Gerngross TU (2007) Glycosylation engineering in yeast:

the advent of fully humanized yeast. Curr Opin Biotechnol 18: 387-392

59. Mattanovich D, Callewaert N, Rouzé P, Lin YC, Graf A, Redl A, Tiels

P, Gasser B, De Schutter K (2009) Open access to sequence: browsing

the Pichia pastoris genome. Microb Cell Fact 8: 53

60. Küberl A, Schneider J, Thallinger GG, Anderl I, Wibberg D, Hajek T,

Jaenicke S, Brinkrolf K, Goesmann A, Szczepanowski R, Pühler A,

Schwab H, Glieder A, Pichler H (2011) High-quality genome sequence

of Pichia pastoris CBS7435. J Biotechnol 154: 312-320

61. Chung BK, Selvarasu S, Andrea C, Ryu J, Lee H, Ahn J, Lee H, Lee

DY (2010) Genome-scale metabolic reconstruction and in silico analysis

of methylotrophic yeast Pichia pastoris for strain improvement. Microb

Cell Fact 9: 50

62. Smith JJ, Burke A, Bredell H, van Zyl WH, Görgens JF (2012) Com-

paring cytosolic expression to peroxisomal targeting of the chimeric

L1/L2 (ChiΔH-L2) gene from human papillomavirus type 16 in the

methylotrophic yeasts Pichia pastoris and Hansenula polymorpha. Yeast

29: 385-393

63. Mack M, Wannemacher M, Hobl B, Pietschmann P, Hock B (2009)

Comparison of two expression platforms in respect to protein yield

and quality: Pichia pastoris versus Pichia angusta. Protein Expr Purif 66:

165-171

64. Sibirny AA (1996) Pichia methanolica (Pichia pinus MH4), W: Wolf K

(red) Nonconventional Yeasts in Biotechnology. Springer-Verlag, Hei-

delberg, str. 277-291

65. Zimmermann M, Fournier P (1996) Electrophoretic karyotyping of

yeasts, W: Wolf K (red) Nonconventional Yeasts in Biotechnology.

Springer-Verlag, Heidelberg, str. 101-116

66. Sibirny AA, Titorenko VI, Efremov BD, Tolstorukov II (1987) Multi-

plicity of mechanisms of carbon catabolite repression involved in the

synthesis of alcohol oxidase in the methylotrophic yeast Pichia pinus.

Yeast 3: 233-241

67. Sibirny AA, Titorenko VI, Teslyar GE, Petrushko VI, Kucher MM

(1991) Methanol and ethanol utilization in methylotrophic yeast Pichia

pinus wild-type and mutant strains. Arch Microbiol 156: 455-462

68. Titorenko VI, Khodursky AB, Teslyar GE, Sibirny AA (1991) Identifica-

tion of new genes controlling catabolite repression of alcohol oxidase

and catalase synthesis in methylotrophic yeasts Pichia pinus. Genetica

27: 625-635 (w j. rosyjskim)

69. Nakagawa T, Sakai Y, Mukaiyama H, Mizumura T, Miyaji T, Yurimo-

to H, Kato N, Tomizuka N (2001) Analysis of alcohol oxidase isozymes

in gene-disrupted strains of methylotrophic yeast Pichia methanolica. J

Biosci Bioeng 91: 225-227

70. Nakagawa T, Inagaki A, Ito T, Fujimura S, Miyaji T, Yurimoto H, Kato

N, Sakai Y, Tomizuka N (2006) Regulation of two distinct alcohol oxi-

dase promoters in the methylotrophic yeast Pichia methanolica. Yeast

23: 15-22

71. Nakagawa T, Yoshida K, Takeuchi A, Ito T, Fujimura S, Matsufuji Y,

Tomizuka N, Yurimoto H, Sakai Y, Hayakawa T (2010) The peroxi-

somal catalase gene in the methylotrophic yeast Pichia methanolica.

Biosci Biotechnol Biochem 74: 1733-1735

72. Nakagawa T, Fujimura S, Ito T, Matsufuji Y, Ozawa S, Miyaji T, Na-

kagawa J, Tomizuka N, Yurimoto H, Sakai Y, Hayakawa T (2010)

Molecular characterization of two genes with high similarity to the

dihydroxyacetone synthase gene in the methylotrophic yeast Pichia

methanolica. Biosci Biotechnol Biochem 74: 1491-1493

73. Zhai Z, Yurimoto H, Sakai Y (2012) Molecular characterization of Can-

dida boidinii MIG1 and its role in the regulation of methanol-inducible

gene expression. Yeast 29: 293-301

74. Yurimoto H, Sakai Y (2009) Methanol-inducible gene expression and

heterologous protein production in the methylotrophic yeast Candida

boidinii. Biotechnol Appl Biochem 53: 85–92

BAZY DANYCH

http://genome.jgi-psf.org/Hanpo1/Hanpo1.home.html).
http://ergo.integratadgenomics.com/ERGO/

Regulation of gene expression in methylotrophic yeasts

Dorota Grabek-Lejko

, Vladimir Sibirny

, Andriy Sibirny

1,2,

University of Rzeszow, 4 Zelwerowicza St., 35-601 Rzeszow, Poland

Institute of Cell Biology National Academy of Sciences of Ukraine, 14/16 Dragomanowa St., Lviv 79005 Ukraine



e-mail: sibirny@yahoo.com

Key words: methylotrophic yeasts, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Candida boidinii, gene expression

ABSTRACT

Methylotrophic yeasts are unique eukaryotic organisms, that can metabolize toxic one-carbon substrate, methyl alcohol or methanol. About

50 species of methylotrophic yeasts is known, among them 4 species are the best studied:

Pichia methanolica, Hansenula polymorpha, Pichia

pastoris i Сandida boidinii. These organisms, especially P. pastoris i H. polymorpha appeared to be very perspective overproducers of heter-

ologous proteins and nowadays are used for industrial production of some of them.

In this review, we provide information on the organization of the genome, mechanisms of regulation of gene expression and the use of strong

promoters of these yeast species to construct the producers of heterologous proteins. In more details, we analyze genetic control of carbon

and nitrogen catabolic repression in

H. polymorpha and also the identification of metabolites inducing catabolite repression or peroxisome

selective autophagy in the medium with ethanol in the

Pichia methanolica yeast.