BADANIE WPŁYWU OBECNOSCI DETERGENTU NA AKTYWNOŚĆ WYBRANYCH

ENZYMÓW TRAWIENNYCH

1. Badanie wpływu detergentu na działanie lipaz

Lipazy trawią tłuszcze uwalniając kwasy tłuszczowe, które oznacza się za pomocą

miareczkowania roztworem NaOH.

Do dwóch kolbek stożkowych odmierzyć 10 cm

3

oleju, 1cm

3

wody destylowanej (próba

ślepa) lub 1 cm

3

roztworu detergentu o odpowiednim stężeniu (1, 0.1, 0.01, 0.001%) oraz

1cm

3

enzymu (100 mg pankreatyny rozpuścić 100 ml buforu o pH = 7,4). Wstrząsnąć aż do

otrzymania emulsji.

Pierwszą kolbę wstawić do termostatu o temp. 37

o

C. Do drugiej kolby dodać 40 cm

3

alkoholu, 2 krople fenoloftaleiny i miareczkować 0,1 M NaOH do różowego zabarwienia.

Do kolby po inkubacji dodać również 40 cm

3

alkoholu i miareczkować zawartość wobec

fenoloftaleiny roztworem NaOH.

Od wyniku drugiego miareczkowania (próby inkubowanej) odjąć wynik miareczkowania

próby ślepej (nie inkubowanej). Siłę lipolityczną enzymu wyrazić liczbą cm

3

NaOH na 1 cm

3

enzymu.

Uzyskane wyniki przedstawić na papierze milimetrowym w postaci wykresu zależności

aktywności badanego enzymu od stężenia dodanego detergentu.

2. Badanie wpływu detergentu na aktywność enzymów amylolitycznych

Do probówki odmierzyć 5 cm

3

1% roztworu skrobi, 2 cm

3

1% roztworu NaCl, 1 cm

3

wody destylowanej (próba ślepa) lub 1 cm

3

roztworu detergentu o odpowiednim stężeniu (1,

0.1, 0.01, 0.001%) oraz 2cm

3

buforu o pH = 6,8.

Probówkę wstawić na 5 min. do łaźni wodnej o temp. 37

o

C. Następnie dodać 1 cm

3

roztworu enzymu (przygotowanego w ćwiczeniu 1). Zamieszać, wstawić do łaźni wodnej

(37

o

C) i zanotować czas. Dokładnie w odstępach 1 minutowych pobierać 2 krople

inkubowanej mieszaniny i dodawać 3 krople płynu Lugola (J w KJ) i kroplę rozcieńczonego

HCl.

Barwa niebieska z jodem wskazuje na obecność niestrawionej skrobi. Jeśli trawienie

jest w toku, powstaje barwa czerwono-fioletowa. Brak zmiany w barwie świadczy o

rozłożeniu całej skrobi do niskich dekstryn. Jest to punkt achromowy.

Należy zanotować czas osiągnięcia punktu achromowego i obliczyć ilość jednostek

aktywności amylazy w 1 cm

3

enzymu. Za umowną jednostkę aktywności przyjęto taką ilość

amylazy, która w czasie 10 min., w temp. 37

o

C i w pH = 6,8 trawi 50 mg skrobi do

produktów nie dających barwy z jodem. Na przykład, jeśli punkt achromowy osiągnięto po 8

min., to znaczy, że 1 cm

3

enzymu zawiera 10/8 jednostek aktywności.

Uzyskane wyniki przedstawić na papierze milimetrowym w postaci wykresu zależności

aktywności badanego enzymu od stężenia dodanego detergentu.

Uwaga!

Jeśli punkt achromowy osiągnięto w czasie krótszym od 3 min. lub dłuższym od 20 min.,

należy powtórzyć doświadczenie zmniejszając lub zwiększając ilość dodanego enzymu.