Biochemia

ŻYWIENIE CZŁOWIEKA

Ćwiczenie 1

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

1

Ćwiczenie 1

Temat: WŁAŚCIWOŚCI FIZYKO-CHEMICZNE AMINOKWASÓW.

Część teoretyczna

Aminokwasy są to związki organiczne zawierające grupę karboksylową i aminową (zwykle w

położeniu w stosunku do grupy kwasowej). Obok aminokwasów alifatycznych są i takie które
zawierają pierścień aromatyczny, heterocykliczny lub dodatkowe grupy np. -OH,
-SH itp. Z uwagi na obecność dwóch podstawowych grup zdolnych do dysocjacji elektrolitycznej,
aminokwasy mają charakter jonu obojnaczego, reagując zarówno z kwasami jak i z zasadami (two-
rząc sole). Z uwagi na obecność węgla asymetrycznego związki te (z wyjątkiem glicyny) tworzą
dwa izomery przestrzenne, z których jedynie forma L występuje naturalnie. Szczegóły dotyczące
budowy i właściwości aminokwasów należy przyswoić w oparciu o dostępne podręczniki bioche-
mii.

Klasyfikacja aminokwasów

Aminokwasy dzieli się na grupy systematyczne w zależności od różnych kryteriów. Za naj-

ważniejszy uważa się podział aminokwasów pod względem ich budowy chemicznej. Inne podziały
to występowanie lub brak aminokwasów w białkach (aminokwasy białkowe i niebiałkowe) i wresz-
cie zdolność organizmów zwierzęcych i człowieka do syntezy poszczególnych aminokwasów (ami-
nokwasy endogenne i egzogenne). Szczegóły dotyczące klasyfikacji aminokwasów należy uzupeł-
nić z podręcznika.

Ogólne reakcje aminokwasów
1. ESTRYFIKACJA GRUPY KARBOKSYLOWEJ AMINOKWASU.

Estryfikacja grupy karboksylowej aminokwasu z grupą hydroksylową alkoholu zachodzi

zgodnie z reakcją:

O

C

O

C

H

2

N

R

H

+

HO-CH

2

-CH

3

O

C

O

C

H

2

N

R

H

-CH

2

-CH

3

+

H

2

O

H

aminokwas alkohol ester

Estry te w przeciwieństwie do aminokwasów są lotne a reakcja ich powstawania bywa wyko-

rzystywana w chromatografii gazowej, za pomocą której rozdziela się w sposób zautomatyzowany
substancje lotne.

2. TWORZENIE SIĘ WIĄZANIA PEPTYDOWEGO.

Wiązanie peptydowe tworzy się w reakcji grupy karboksylowej jednego aminokwasu z grupą

aminową drugiego aminokwasu zgodnie z reakcją:

H N-CH-COO + H N-CH-COO

R

R

1

2

+

+

_

_

|

|

3

3

H O

2

H N-CH-

CH-COO

+

_

_

R

R

1

2

3

|

|

CO-NH-

Reakcja ta ma szczególnie ważne znaczenie gdyż w ten sposób tworzą się peptydy i białka.

Biochemia

ŻYWIENIE CZŁOWIEKA

Ćwiczenie 1

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

2

Część praktyczna

A) REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE AMINOKWASÓW

1. REAKCJA Z NINHYDRYNĄ

Charakterystyczna dla -aminokwasów ponieważ przebiega wówczas, gdy w położeniu w

stosunku do grupy karboksylowej znajduje się grupa aminowa. Przebiega ona w dwóch etapach:

+

+

3

NH

2

CO

R

O

C-H

+

H

C

C

C

O

O

OH

2

R

COOH

H N-C-H

+

OH

OH

O

C

C

C

O

ninhydryna aminokwas ninhydryna zredukowana

ninhydryna

zredukowana

+ ninhydryna + NH

3

C

C

C

O

O

N

C

_

C

C

O

O

+ 3 H O

2

fioletowo-niebieski kompleks barwny

Wydzielający się w czasie reakcji CO

2

można mierzyć manometrycznie w aparacie van Slyk-

e'a, zaś natężenie barwy kompleksu można mierzyć kolorymetrycznie. Reakcja ta daje więc pod-
stawy do ilościowego oznaczenia badanych aminokwasów, a także jest podstawową analizą jako-
ściową

.

Wykonanie:

1 ml badanego aminokwasu i 0,5 ml ninhydryny wymieszać w probówce i ogrzewać nad pal-

nikiem do wrzenia. Po chwili pojawia się fioletowe zabarwienie, a w przypadku proliny i hydroksy-
proliny zabarwienie żółte.

2. REAKCJA NA GRUPĘ TIOLOWĄ –SH

W środowisku silnie zasadowym z aminokwasów siarkowych takich jak cysteina odszczepia

się grupa -SH w postaci siarczków. Siarczki w obecności soli ołowiu tworzą czarny osad siarczku
ołowiu.

CH SH

CH NH

COOH

2

2

_

_

|

|

a/

2 NaOH

+

|

|

_

_

2

2

COOH

CH NH

CH OH

+ Na S + H O

2

2

b/

Na S + Pb(CH COO)

2

2

3

PbS + 2 CH COONa

3

czarny osad

Wykonanie:

1 ml 0,05% cystyny lub cysteiny i 10 kropli 20% NaOH ogrzewać w probówce nad palnikiem

do wrzenia. Następnie dodać 3-4 krople nasyconego roztworu octanu ołowiu i w dalszym ciągu
podgrzewać (do odparowania połowy objętości płynu). Obserwuje się wytrącanie czarnego siarczku
ołowiu, z którego po dodaniu kilku kropli stężonego HCl wydziela się siarkowodór

.

II

I

Biochemia

ŻYWIENIE CZŁOWIEKA

Ćwiczenie 1

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

3

3. REAKCJA NA WYKRYCIE PIERŚCIENIA INDOLU (PRÓBA ADAMKIEWICZA).

Związki zawierające pierścień indolu między innymi tryptofan w środowisku mocno kwaso-

wym, w obecności aldehydów dają barwne produkty kondensacji. W próbie Adamkiewicza stosuje
się kwas glioksalowy CHOCOOH.

N

COOH

CHNH

CH

H

2

2

2

2

H

CH

CHNH

COOH

N

+

O

C-H

COOH

COOH

CHNH

CH

2

2

H

C

COOH

N

H

+ H O

2

2

kompleks barwy fioletowej

Wykonanie:

Do 1 ml roztworu tryptofanu dodać 0,5 ml kwasu glioksalowego i wymieszać dokładnie w

probówce, następnie płyn podwarstwić 1 ml stężonego kwasu siarkowego (nie mieszać!), wstawić
do wrzącej łaźni wodnej na 2 minuty. Na granicy płynów pojawia się fioletowy pierścień.

4. WYKRYCIE PIERŚCIENIA IMIDAZOLOWEGO W REAKCJI Z KWASEM
PARADWUAZOBENZENO-SULFONOWYM.

Pierścień imidazolowy ulega reakcji z kwasem paradwuazobenzenosulfonowym z wytworze-

niem kompleksu o barwie pomarańczowo-żółtej. Reakcję tę daje histydyna.

Wykonanie:

Sporządzić kwas p-dwuazobenzenosulfonowy przez zmieszanie 1 ml 0,5% kwasu sulfanilo-

wego i 1 ml 0,5% NaNO

2

. Roztwór zobojętnić krystalicznym Na

2

CO

3

dodając do probówki węgla-

nu tak dużo dopóki roztwór się burzy. Następnie dodać histydyny i obserwować tworzenie się bar-
wy pomarańczowo-żółtej.

Biochemia

ŻYWIENIE CZŁOWIEKA

Ćwiczenie 1

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

4

5. REAKCJA NA PIERŚCIEŃ AROMATYCZNY. PRÓBA KSANTOPROTEINOWA.

Związki aromatyczne ogrzewane z kwasem azotowym ulegają nitrowaniu z utworzeniem

barwy żółtej. Pochodne nitrowe w środowisku alkalicznym przechodzą w sole sodowe o barwie
pomarańczowej.

HO

CH

2

CH

COOH

NH

2

+ HNO

3

H

2

SO

4

H

2

O

2

HO

O

2

N

O

2

N

CH

2

CH

NH

2

COOH

2

barwa żółta

Wykonanie:

2 ml tryptofanu lub tyrozyny zalać 2 ml stężonego HNO

3

i podgrzewać kilka minut na łaźni

wodnej. Roztwór przybiera barwę żółtą. Po oziębieniu zalkalizować 20% NaOH. W miarę dodawa-
nia ługu rozwija się barwa pomarańczowa.

B) WYKAZANIE AMFOTERYCZNYCH WŁAŚCIWOŚCI AMINOKWASÓW

Charakter amfoteryczny aminokwasów ujmuje graficznie krzywa miareczkowania wodnych

roztworów aminokwasów mocnymi kwasami i zasadami. Przedstawia ona zależność wartości pH
miareczkowanego roztworu aminokwasu od ilości dodawanych moli kwasu lub zasady. Miarecz-
kowanie roztworu aminokwasu połączone z równoczesnym pomiarem pH roztworu pozwala na do-
świadczalne wyznaczenie krzywej dysocjacji aminokwasu i wartości pK jego grup funkcyjnych.

Wykonanie:

W dwóch zlewkach na 100 ml przygotować po 10 ml 0,1 M roztworu glicyny (dodać ok. 30

ml wody, by można było zanurzyć elektrodę). Roztwór w jednej zlewce miareczkować potencjome-
trycznie HCl, a w drugiej zlewce miareczkować NaOH.

Miareczkowanie kwasem: zmierzyć wyjściowe pH roztworu glicyny i stopniowo dodawać po

0,5 ml 0,1 M HCl, mierząc za każdym razem pH. Po dodaniu 3 ml kwasu, zwiększyć porcję doda-
wanego kwasu do 1 ml. Pomiar zakończyć po dodaniu 12 ml kwasu.

Miareczkowanie ługiem: zmierzyć wyjściowe pH roztworu glicyny i stopniowo dodawać po

0,5 ml 0,1 M NaOH, mierząc za każdym razem pH. Po dodaniu 3 ml ługu, zwiększyć porcję doda-
wanego ługu do 1 ml. Pomiar zakończyć po dodaniu 12 ml ługu.

Pomiaru pH dokonywać na pH-metrze. Wykreślić krzywą potencjometrycznego miareczko-

wania nanosząc na oś odciętych ilość ml kwasu i ługu, a na oś rzędnych wartości pH. Z wykresu
odczytać wartości pK dla kwasu i ługu oraz wartość pI.

C. ROZDZIAŁ AMINOKWASÓW METODĄ

CHROMATOGRAFII BIBUŁOWEJ ROZDZIELCZEJ

Chromatografia to technika, w której unoszone przez fazę ruchomą substancje rozdzielają się

dzięki różnicom w ich właściwościach fizyko-chemicznym (wielkość cząsteczek, hydrofobowość,
powinowactwo itp.) oddziałując z fazą stacjonarną. Ze względu na siły fizyczne, które odgrywają
rolę w procesie rozdziału oraz stan skupienia fazy stacjonarnej – wyodrębnia się: chromatografię
adsorpcyjną i podziałową. Rozdział składników w chromatografii adsorpcyjnej (chromatografia
w układzie ciecz - ciało stałe) uwarunkowany jest głównie różnicami w położeniu i charakterze po-
larnych podstawników w cząsteczkach adsorbatu (substancji zatrzymanej na powierzchni adsorben-
tu); w podziałowej (chromatografia w układzie ciecz - ciecz) – odmienną rozpuszczalnością solutu
(substancji rozpuszczonej w układzie rozwijającym) w obu fazach ciekłych.

Biochemia

ŻYWIENIE CZŁOWIEKA

Ćwiczenie 1

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

5

Techniki chromatograficzne można podzielić bardziej szczegółowo i wyróżnić dodatkowo:

chromatografię żelową (sita molekularnego), jonowymienną, powinowactwa, oddziaływań hydro-
fobowych. Z kolei ze względu na technikę pracy wyróżnia się dwa rodzaje chromatografii: kolum-
nową i planarną, do tej drugiej zalicza się chromatografię bibułową oraz cienkowarstwową. W
chromatografii bibułowej nośnikiem fazy stacjonarnej (najczęściej polarnej) jest odpowiednio spre-
parowana bibuła filtracyjna. Z uwagi na kierunek migracji fazy ruchomej w bibule wyróżnia się
chromatografię jednowymiarową i dwuwymiarową, a ze względu na kształt bibuły – chromatogra-
fię arkuszową, paskową oraz krążkową.

Wykonanie:

Z bibuły Whatman 1 wyciąć pasek o szerokości 15 cm i długości 22 cm. W odległości 2 cm

od dołu zaznaczyć miękkim ołówkiem linię startową i nanieść mikropipetą mieszaninę badanych
aminokwasów oraz wzorce. Po wysuszeniu plam zawiesić pasek na pręciku szklanym i umieścić w
komorze z układem rozpuszczalników. Rozwijać minimum 2 godz. Po upływie tego czasu chroma-
togram wyjąć z komory, wysuszyć w suszarce w temp. 100

o

C. Zwilżyć pasek roztworem ninhydry-

ny w acetonie lub izatyny w acetonie i ponownie wysuszyć. Na podstawie różnic w szybkości wę-
drówki zidentyfikować badane aminokwasy

.

Załącznik:

Ostatnie zmiany: 13.02.2013