Biochemia
ŻYWIENIE CZŁOWIEKA
Ćwiczenie 6
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
1
Ćwiczenie 6
Temat: OZNACZANIE ZAWARTOŚCI TŁUSZCZÓW I ICH POCHODNYCH
W MATERIALE BIOLOGICZNYM.
Część teoretyczna
Tłuszczowce stanowią złożoną grupę związków nierozpuszczalnych w wodzie, a rozpusz-
czalnych w rozpuszczalnikach organicznych. Tłuszczowce są dzielone na tłuszcze proste i tłuszcze
złożone. Związki te występują we wszystkich organizmach żywych jako materiał zapasowy i ener-
getyczny oraz pełnią rolę strukturalną, jako składnik błon komórkowych.
Tłuszcze proste dzielą się na właściwe i woski.
Tłuszcze właściwe są to estry trójwodorotlenowego alkoholu - glicerolu i wyższych kwasów
tłuszczowych. Ogólny wzór przedstawia się następująco:
H - C - O - C - R
H - C - O - C - R
O
O
2
1
2
3
2
O
H - C - O - C - R
R
1
, R
2
, R
3
- rodniki alkilowe
Woski pod względem chemicznym są mieszaniną estrów jednowodorotlenowych alkoholi o
16 - 31 atomach węgla i jednokarboksylowych kwasów tłuszczowych nasyconych i nienasyconych
oraz wolnych alkoholi jednowodorotlenowych, wolnych kwasów tłuszczowych i węglowodorów ty-
pu parafin.
Tłuszcze złożone pod względem chemicznym stanowią bardzo różnorodną grupę związków,
których wspólną cechą jest zawartość kwasów tłuszczowych w cząsteczce.
Systematyka tłuszczów złożonych w uproszczeniu przedstawia się następująco:
TŁUSZCZE ZŁOŻONE
GLICEROLIPIDY
SFINGOLIPIDY
FOSFOGLICEROLIPIDY GLIKOGLICEROLIPIDY FOSFOSFINGOLIPIDY GLIKOSFINGOLIPIDY
FOSFSTYDYLOSERYNY
SFINGOMIELINY
GANGLIOZYDY
FOSFATYDYLOCHOLINY
CEREBROZYDY
FOSFATYDYLOINOZYTYDY
FOSFATYDYLOETANOLAMINY
Tłuszcze w żywności pełnią trzy podstawowe funkcje: są źródłem niezbędnych nienasyconych
kwasów tłuszczowych, odgrywają rolę nośnika witamin rozpuszczalnych w tłuszczach (A, D, E i K)
oraz są głównym i najbardziej skoncentrowanym źródłem energii. Biorą także udział w syntezie
niektórych hormonów tkankowych – np. prostaglandyn.
Tłuszcze jadalne są pochodzenia roślinnego lub zwierzęcego. Tłuszcze roślinne otrzymuje się
z nasion lub z miąższu owoców, natomiast tłuszcze zwierzęce pochodzą z tkanek lub mleka zwie-
rząt. W celu wydobycia lipidów nasiona roślin oleistych poddaje się tłoczeniu lub ekstrakcji, a czę-
fosfa-
tydylo-
seryny
Biochemia
ŻYWIENIE CZŁOWIEKA
Ćwiczenie 6
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
2
sto łączy się obie metody. Z miąższu owoców oleje wydziela się przez tłoczenie lub odwirowanie.
Wykorzystuje się również metodę ekstrakcji. Do ekstrakcji lipidów najczęściej stosuje się benzynę
ekstrakcyjną. Roztwór zwany miscelą poddaje się destylacji w celu oddzielenia rozpuszczalnika.
Tłuszcze zwierzęce otrzymuje się przez wytapianie z rozdrobnionej tkanki. Oleje rybne najczęściej
izoluje się przez rozgotowanie tkanki, a następnie oddzielenie od frakcji wodno-białkowej za po-
mocą wirówek.
W zależności od sposobu wydobywania, surowe tłuszcze zwane są tłoczonymi lub ekstrak-
cyjnymi. Tłuszcze ekstrakcyjne z reguły mają więcej substancji towarzyszących. Tłuszcze uzyskane
przez tłoczenie lub ekstrakcję oprócz triacylogliceroli zawierają wiele innych substancji, które ogól-
nie, choć nie zawsze słusznie, są zwane zanieczyszczeniami. Większość metod analizy zawartości
tłuszczów w materiale biologicznym polega na oznaczeniu wagowym wyekstrahowanych tłusz-
czów, bądź też na oznaczeniu jednego z charakterystycznych składników występujących w czą-
steczce tłuszczu.
Istotny problem w analizie lipidów wynika z tego, że na ogół należą one do związków wy-
jątkowo labilnych, a zwłaszcza mało odpornych na działanie czynników utleniających, w tym tlenu
atmosferycznego. Przemiany nienasyconych lipidów spowodowane utlenianiem tlenem atmosfe-
rycznym są główną przyczyną niepożądanych zmian wielu artykułów spożywczych. W praktyce
przemysłowej do stabilizacji tłuszczów i innych artykułów żywnościowych zawierających lipidy
stosuje się witaminę E (tokoferole, tokotrienole), uważaną za uniwersalny przeciwutleniacz. Twier-
dzi się nawet, że zwiększeniu ilości kwasów polienowych w diecie powinien towarzyszyć wzrost
udziału w niej witaminy E. Wszystkie witaminy z grupy E są pochodnymi albo tokolu, czyli 2-
metylo-2-(4’,8’,12’-trimetylotridecylo)-chroman-6-olu,
albo
tokotrienolu, czyli 2-metylo-2-
(4’,8’,12’-trimetylotrideka-3’,7’,11’-trienylo)-chroman-6-olu. W temperaturze pokojowej są sub-
stancjami oleistymi, nierozpuszczalnymi w wodzie, łatwo rozpuszczalnymi w tłuszczach i rozpusz-
czalnikach tłuszczowych. W środowisku beztlenowym są odporne na działanie podwyższonej tem-
peratury, nawet do 200
o
C oraz kwasów i zasad. Witaminy te są bardzo wrażliwe na działanie pro-
mieni UV oraz tlenu. Koncentraty naturalnej witaminy E otrzymuje się z olejów roślinnych, zwłasz-
cza z oleju z kiełków pszenicy, oleju sojowego i bawełnianego. Duże ilości witaminy E zawiera
również sałata, jaja i masło.
Tłuszcze są dobrym rozpuszczalnikiem dla witamin z grupy A, D, E i K. Witamina A, wywo-
dząca się z karotenoidów, zawarta jest w tranie. W maśle i tranie występuje duża ilość witamin z
grupy D. W olejach roślinnych znajdują się tokoferole - witaminy z grupy E. W tłuszczach roślin-
nych, w mniejszym stopniu także w tłuszczach zwierzęcych występują karotenoidy nadające im żół-
toczerwone zabarwienie.
Kwasy występujące w tłuszczach należą prawie wyłącznie do jednokarboksylowych kwasów
alifatycznych nasyconych lub nienasyconych, zbudowanych z parzystej liczby atomów węgla i z
prostych, nierozgałęzionych łańcuchów. Wolne kwasy tłuszczowe wraz ze wzrostem ilości atomów
węgla w cząsteczce wykazują spadek rozpuszczalności, spadek stopnia dysocjacji i lotności oraz
wzrost temperatury topnienia. Kwasy nienasycone zawierają jedno lub kilka podwójnych wiązań.
Charakterystyczne jest, że wszystkie nienasycone kwasy tłuszczowe występują w konfiguracji cis.
Wiązania podwójne, jeżeli występują w większej ilości, ułożone są w układ izolowany. Kwasy
tłuszczowe otrzymuje się z tłuszczów przez ich hydrolizę, którą można przeprowadzić za pomocą
kwasów mineralnych, zasad, pary wodnej, enzymów (lipaz).
Biochemia
ŻYWIENIE CZŁOWIEKA
Ćwiczenie 6
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
3
Część praktyczna
A) IZOLACJA LECYTYNY I CHOLESTEROLU Z ŻÓŁTKA JAJA KURZEGO
Żółtko jaj ptasich zawiera dużo tłuszczów złożonych, głównie lecytyn i kefalin, jest także
dość bogatym źródłem cholesterolu dlatego też można je wykorzystać jako dogodny materiał do
otrzymania stosunkowo czystej frakcji zarówno lecytyn jak i cholesterolu. W preparatyce fosfolipi-
dów wykorzystuje się ich słabą rozpuszczalność w acetonie, którym wytrąca się je z roztworu ete-
rowego lub alkoholowego. Inne lipidy, jak również cholesterol, pozostają w tych warunkach w roz-
tworze. W celu wydzielenia z mieszaniny fosfolipidów lecytyn przeprowadza się je w kompleks z
CdCl
2
. Kompleks kefalin rozpuszcza się w etanolu, zaś kompleks lecytyn wypada z roztworu. W ce-
lu wydzielenia z acetonowego roztworu cholesterolu związek ten po uprzednim zmydleniu towarzy-
szących mu tłuszczów prostych ekstrahuje się eterem i po odparowaniu rozpuszczalnika, krystalizu-
je z metanolu.
1. IZOLACJA LECYTYN
Żółtko oddzielić od białka i zalać 75 ml mieszaniny chloroform-etanol (2:1). Mieszać na mie-
szadle magnetycznym przez 10 min. Otrzymaną mieszaninę przesączyć do suchej kolby przez duży
karbowany sączek z bibuły miękkiej zwilżony etanolem. Przesącz przenieść do parowniczki i czę-
ściowo odparować ogrzewając na wrzącej łaźni wodnej (w przypadku odparowania do sucha pozo-
stałość rozpuścić w 10 ml chloroformu). Chloroformowy roztwór wkroplić, mieszając, do 30 ml
acetonu. Wytrąca się osad fosfolipidów, który po przesączeniu i przemyciu 5 ml acetonu podzielić
na 5 części i poddać opisanym poniżej testom jakościowym, charakterystycznym dla poszczegól-
nych składników lecytyny. Otrzymany przesącz zachować do analizy cholesterolu.
2. REAKCJA NA OBECNOŚĆ GLICEROLU - PRÓBA AKROLEINOWA
Glicerol, podstawowy składnik tłuszczów właściwych i fosfoglicerydów w wysokiej tempera-
turze w obecności bezwodnego KHSO
4
lub CuSO
4
traci dwie cząsteczki wody i przechodzi w nie-
nasycony aldehyd - akroleinę o ostrym, duszącym zapachu.
glicerol
akroleina
Wykonanie:
Odrobinę osadu lecytyny zadać w probówce 1 ml 96% etanolu i dokładnie rozpuścić. Dodać
około 0,2 g bezwodnego KHSO
4
lub CuSO
4
i ogrzewać do momentu wydzielenia się par akroleiny
o charakterystycznym zapachu.
3. REAKCJA NA OBECNOŚĆ WYŻSZYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH (TWORZE-
NIE MYDEŁ)
Tłuszcze w obecności zasad hydrolizują z uwolnieniem glicerolu i soli kwasów tłuszczowych.
Sole sodowe i potasowe charakteryzują się dobrą rozpuszczalnością w wodzie.
Wykonanie:
Odrobinę osadu lecytyn zadać w próbce 3 ml 5% etanolowego roztworu NaOH i ogrzewać we
wrzącej łaźni wodnej przez kilka minut. Następnie dodać około 10 ml H
2
O, rozpuścić mydło, inten-
sywnie wstrząsając probówką. Obserwować pienienie się roztworu.
Biochemia
ŻYWIENIE CZŁOWIEKA
Ćwiczenie 6
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
4
4. REAKCJA NA OBECNOŚĆ FOSFORANU
Niewielką ilość osadu lecytyny rozpuścić w probówce w 1 ml 96% etanolu, dodać 2 ml 20%
NaOH i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej około 10 minut. Następnie zobojętnić wobec fenolofta-
leiny 5 M HCl i przesączyć. Do 2 ml przesączu dodać 0,5 ml odczynnika molibdenowego i 0,5 ml
reduktora metolowego. Probówkę ogrzać ponownie. W obecności jonów ortofosforanowych po-
wstaje kompleks fosforomolibdenianu amonowego o barwie żółtej, który po dodaniu reduktora re-
dukuje się do błękitu molibdenowego.
5. REAKCJA NA OBECNOŚĆ CHOLINY
Odrobinę lecytyny ogrzewać z 5 ml 20% NaOH w probówce umieszczonej we wrzącej łaźni
wodnej. Wydziela się powstała w wyniku rozkładu choliny trimetyloamina o charakterystycznym
zapachu śledzi.
6. WYKRYWANIE OBECNOŚCI CHOLESTEROLU
W probówce umieścić 1,5 ml roztworu cholesterolu. Dodać około 1,5 ml stężonego H
2
SO
4
.
Obserwować pojawienie się czerwono-purpurowego lub niebieskiego zabarwienia.
B) WYKRYWANIE WITAMIN W TŁUSZCZACH
1. WYKRYWANIE WITAMINY A
Karotenowce i witamina A wchodzą w reakcję barwną z nasyconym chloroformowym roz-
tworem chlorku antymonowego (SbCl
3
), dając zabarwienie niebieskie, które w obecności cholekal-
cyferolu (witaminy D) szybko przechodzi w fioletowo czerwone. Podczas wykonywania analiz
używać wyłącznie suchego szkła ponieważ woda powoduje hydrolizę SbCl
3
.
Wykonanie:
Do pięciu suchych probówek odpipetować po 0,5 ml nasyconego roztworu SbCl
3
w chloro-
formie. Następnie do pierwszej dodać 1 kroplę chloroformowego roztworu witamin A + D, do dru-
giej 1 kroplę chloroformowego roztworu witaminy A, do trzeciej 1 kropli chloroformowego roztwo-
ru witaminy D, do czwartej 5 kropli rozpuszczonego masła lub tranu a do piątej 1 kroplę chlorofor-
mu (ślepa). Porównać barwy próby ślepej z próbami zawierającymi witaminy oraz tłuszcz, zinter-
pretować uzyskane wyniki.
2. WYKRYWANIE STEROIDÓW - WITAMINY D I CHOLESTEROLU (PRÓBA LIE-
BERMANNA I BURCHARDA)
Tłuszczom naturalnym często towarzyszą związki steroidowe, zwłaszcza cholesterol, tworzą-
cy estrowe połączenia z kwasami tłuszczowymi.
W warunkach bezwodnych stężony roztwór H
2
SO
4
i bezwodnik kwasu octowego odwadniają
cząsteczkę cholesterolu, co prowadzi do powstania dodatkowego podwójnego wiązania, sprzężone-
go z wiązaniem podwójnym obecnym w cząsteczce cholesterolu. Związki zawierające podwójne
wiązania sprzężone są barwne i wybiórczo pochłaniają promienie świetlne o określonej długości fa-
li. W próbie Liebermanna i Burcharda powstaje zielono zabarwiony kwas jednosulfonowy dichole-
stadienu.
Wykonanie:
W dwóch suchych probówkach umieścić po 2 krople różnych tłuszczów. Do każdej dodać po
1 ml chloroformu i wymieszać. Do każdej probówki dodać po 0,5 ml bezwodnika kwasu octowego*
i ostrożnie po ściankach probówek po 2 krople stężonego roztworu H
2
SO
4
. Tworzą się produkty re-
akcji o barwie różowej przechodzącej przez fioletową i niebieską w zieloną.
* bezwodniki kwasowe – tlenki, które łącząc się z wodą tworzą kwasy lub powstające z kwasów przez odszczepienie
wody pod wpływem ogrzewania lub reakcji ze środkami odwadniającymi (np. bezwodnik kwasu octowego 2
CH
3
COOH = (CH
3
COO)
2
O + H
2
O). Przemiana taka jest zazwyczaj odwracalna.
Biochemia
ŻYWIENIE CZŁOWIEKA
Ćwiczenie 6
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
5
3. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI WITAMIN E W TŁUSZCZACH ROŚLINNYCH I
ZWIERZĘCYCH.
Witamina E wchodzi w reakcję z barwnym wolnym rodnikiem 1,1-difenyl-2-pikryl-
hydrazylem (DPPH), który w reakcji z tokoferolem ulega przekształceniu w bezbarwny produkt.
Wykonanie:
Odważyć w probówkach 50 mg tranu, 50 mg oleju roślinnego, 150 mg margaryny, 500 mg
masła i 500 mg smalcu. Dodać po 20 ml roztworu DPPH. Do probówki z masłem i smalcem dodać
szczyptę bezwodnego siarczanu magnezu. Wszystkie probówki zamknąć korkiem i wytrząsać do
uzyskania zawiesiny. Odstawić na 30 min w ciemne miejsce. Zawartość probówek wymieszać i są-
czyć do klarowności przez podwójny twardy sączek. Zmierzyć absorbancję przy 529 nm względem
etanolu.
Przygotowanie krzywej kalibracyjnej:
Do 6-ciu probówek rozlać wzorzec i chloroform według tabelki. Wprowadzić po 10 ml
DPPH. Zawartość probówek dokładnie wymieszać i odstawić w ciemne miejsce na 30 minut. Prze-
czytać absorbancję przy 529 nm względem etanolu i sporządzić krzywą wzorcową.
wzorzec tokoferolu
(µl)
chloroform
(µl)
jednostki
tokoferolu
200
0
0,060
150
50
0,045
100
100
0,030
50
150
0,015
25
175
0,0075
0
200
0,000
Obliczenie wyników:
Z krzywej wzorcowej odczytać stężenie tokoferolu w badanych próbkach. Uwzględniając ma-
sę naważonych próbek i ilość dodawanego do nich DPPH wyliczyć ilość witaminy w przeliczeniu
na 1 g badanego surowca.
Ostatnie zmiany 13.02.2013