Biochemia

ŻYWIENIE CZŁOWIEKA

Ćwiczenie 7

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

1

Ćwiczenie 7

Temat: OTRZYMYWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH

I IDENTYFIKACJA ICH PODSTAWOWYCH SKŁADNIKÓW.

Część teoretyczna

Kwasy nukleinowe są, obok białek, podstawowymi składnikami komórek zwierzęcych,

roślinnych i drobnoustrojów a także wirusów. Występują one we wszystkich elementach
komórkowych oraz w rozpuszczalnych frakcjach komórek. Związki te biorą udział w
podstawowych procesach biologicznych: syntezie białka, podziale komórki, przenoszeniu cech
dziedzicznych, są wreszcie podstawowym materiałem genetycznym. Hydroliza kwasów
nukleinowych prowadzi do powstania pojedynczych nukleotydów - nukleotyd stanowi więc
podstawową cegiełkę w budowie kwasów nukleinowych. Nukleotydy składają się z zasady
organicznej (pochodnej puryny lub pirymidyny), pentozy (D-rybozy lub D-2-deoksyrybozy) oraz
kwasu ortofosforowego. W skład kwasów nukleinowych wchodzą następujące zasady
pirymidynowe: cytozyna, uracyl, tymina.

N

N

O

NH

2

H

H

O

N

N

N

N

O

H

OH

OH

CH

3

cytozyna uracyl tymina

Z zasad purynowych w kwasach nukleinowych występują: adenina, guanina i hipoksantyna.

2

NH

N

N

N

N

H

H

N

N

N

N

H

N

N

N

N

H N

H

O

2

OH

adenina guanina hipoksantyna

Zasada organiczna łączy się z rybozą lub deoksyrybozą wiązaniem N-glikozydowym tworząc

nukleozyd, a po przyłączeniu estrowo w pozycji C

5

kwasu ortofosforowego tworzy się nukleotyd.

Poszczególne nukleotydy łączą się ze sobą za pomocą cząsteczek kwasu fosforowego wiązaniem
dwuestrowym w cząsteczki kwasów nukleinowych. W zależności od tego czy w skład nukleotydu
wchodzi ryboza czy deoksyryboza, wyróżnia się kwasy rybonukleinowe (RNA) i kwasy
deoksyrybonukleinowe (DNA).

Biochemia

ŻYWIENIE CZŁOWIEKA

Ćwiczenie 7

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

2

N

N

O

P

O

CH

2

O

O

OH

O

O

2

CH

P

O

OH

N

N

NH

2

N

N

OH

O

O

2

CH

O

P

N

N

O

H

NH

2

2

NH

N

N

O

Ponadto DNA i RNA różnią się jeszcze składem zasad azotowych. W skład DNA wchodzą

zasady: adenina, tymina, guanina, cytozyna. Zaś w cząsteczce kwasów rybonukleinowych brak jest
tyminy a występuje uracyl.

Artykuły żywnościowe na ogół nie są bogatym źródłem kwasów nukleinowych. W mięśniach

ryb zawartość RNA mieści się w granicach od kilkudziesięciu do ponad 100 mg/100 g, a DNA
zaledwie kilka mg/100 g. Natomiast wątroba zwierząt rzeźnych oraz biomasa drobnoustrojów
zawiera od kilku do kilkunastu procent kwasów nukleinowych w suchej masie. Bogaty w kwasy
nukleinowe jest kawior. W artykułach żywnościowych występują również nukleotydy i produkty ich
przemian.

Cząsteczki DNA i RNA – silne polianiony - w komórkach są z reguły mocno związane z

kationowymi białkami. Połączenia kwasów nukleinowych i białek noszą nazwę nukleoprotein.
Białka związane z RNA to przede wszystkim białka rybosomowe. W deoksyrybonukleoproteinach
w charakterze komponentu białkowego występują głównie protaminy, histony i białka niehistonowe
(chromatynowe). Sposób połączenia komponenty białkowej i nukleinowej w nukleoproteinach nie
jest do końca jasny. Sugeruje się istnienie kilku typów tych połączeń. Największe uznanie zyskały:
1) elektrostatyczne oddziaływania (wiązania typu soli), gdzie rolę kwasu spełniają reszty
fosforowe kwasów nukleinowych lub grupy karboksylowe aminokwasów kwasowych, a rolę zasady
– grupy aminowe aminokwasów zasadowych lub grupy aminowe zasad purynowych i
pirymidynowych; 2) wiązania wodorowe między odpowiednimi atomami azotu i tlenu zasad
azotowych i aminokwasów; 3) wiązania chelatowe, w których jon dwuwartościowego metalu łączy
się ze związkiem organicznym dwoma wiązaniami, tj. jonowym, w którym zastępuje np. jon
wodoru i drugim – koordynacyjnym – z inną grupą związku organicznego. Nukleoproteiny bardzo
opornie rozpuszczają się w czystej wodzie, są niestabilne i bardzo wrażliwe na działanie różnych
czynników fizycznych i chemicznych powodujących ich degradację. Niewielki dodatek zasad, np.
NaHCO

3

, zwiększa rozpuszczalność nukleoprotein, powoduje jednak odszczepienie się kwasów

nukleinowych od białka, a nawet degradację kwasów rybonukleinowych bardziej wrażliwych na
hydrolizę zasadową.

Biochemia

ŻYWIENIE CZŁOWIEKA

Ćwiczenie 7

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

3

Część praktyczna

A) OTRZYMYWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH.

Znane są liczne metody wyodrębniania i oczyszczania kwasów nukleinowych. Najprostszą

metodą wydzielania nukleoprotein z tkanek zwierzęcych jest ich ekstrakcja z tkanki roztworami
chlorku sodu. Odpowiedni dobór stężeń roztworów chlorku sodu umożliwia oddzielne
wyodrębnianie z tkanek rybonuleoprotein i deoksyrybonukleoprotein. Tkankę należy ekstrahować
0,6% roztworem NaCl, w którym rozpuszczają się rybonukleoproteiny. Pozostałe w osadzie
deoksyrybonukleoproteiny ekstrahuje się 10% roztworem NaCl. Deoksyrybonukleoproteiny można
następnie wytrącić za pomocą alkoholu etylowego. Aby uniknąć depolimeryzcji nukleoprotein
wszystkie czynności należy wykonywać w temperaturze 0-2

o

C. Do homogenizacji tkanki stosuje się

roztwór chlorku sodu z dodatkiem cytrynianu sodu, który inaktywuje nukleazy.

1. OTRZYMYWANIE DNA Z WĄTROBY.

Wykonanie:

10 g zamrożonej wątroby pokroić na kawałki i homogenizować z 40 ml

oziębionego do

temperatury 4

o

C 0,6% NaCl w cytrynianie sodu przez 3 minuty. Homogenat wirować 10 minut.

Supernatant odrzucić. Otrzymany osad przenieść do zlewki na 250 ml, zalać 50 ml oziębionego
10% NaCl. Zlewkę umieścić w łaźni z lodem i osad ekstrahować przez 15 minut mieszając
energicznie. Po zakończeniu ekstrakcji zawiesinę odwirować. Płyn znad osadu zawierający
uwolnione cząsteczki DNA zlać do zlewki.

Wytrącanie DNA z roztworu:

W zlewce na 500 ml

przygotować 120 ml oziębionego alkoholu etylowego 96% i powoli

cienkim strumieniem wlewać otrzymany supernatant, w którym znajdują się kwasy DNA. Mieszać
ciągle bagietką, obserwować wytrącanie się włókien DNA. Wytrącające się włókna nawinąć na
bagietkę, wysuszyć na bibule i używać do dalszych prób jakościowych.

2. OTRZYMYWANIE RNA Z DROŻDŻY.

Wykonanie :

30 g drożdży piekarskich dokładnie rozetrzeć z 40 ml

0,4% NaOH. Osad odwirować,

supernatant przenieść do zlewki i zakwasić 15 ml 5% kwasu octowego. Roztwór wlać do naczynia
wirówkowego, do którego odmierza się uprzednio 40 ml etanolu zakwaszonego HCl. Po kilku
minutach wytrąca się osad RNA, który po odwirowaniu (3000 obr./min przez 10 minut) i zlaniu
supernatantu należy rozpuścić w małej ilości 0,4% NaOH (maksymalnie 8 ml) i zachować do prób
jakościowych.

B) IDENTYFIKACJA POSZCZEGÓLNYCH SKŁADNIKÓW NUKLEOPROTEIN

Wyróżnia się dwa sposoby badania składników kwasów nukleinowych. Pierwszy z nich

wymaga hydrolizy tych związków do składników podstawowych, tj. kwasu fosforowego, pentozy
oraz zasad azotowych, a następnie ich rozdziału. Drugi sposób badania składników kwasów
nukleinowych związany jest z wywoływaniem reakcji barwnych w preparatach niehydrolizowanych
lub po hydrolizie bez stosowania rozdziału składników podstawowych. Niehydrolizowane kwasy
nukleinowe (DNA i RNA) wykazują reakcję wspólną na obecność pentoz, tzw. reakcję Biala i
Tollensa. Natomiast reakcją odróżniającą oba typy kwasów w formie niehydrolizowanej jest reakcja
Dischego na obecność -D-2-deoksyrybozy (składnik DNA).

Biochemia

ŻYWIENIE CZŁOWIEKA

Ćwiczenie 7

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

4

1. WYKRYWANIE BIAŁKA - PRÓBA BIURETOWA
Wykonanie:

Do identyfikacji białka w badanej próbce kwasu nukleinowego można wykorzystać próbę

biuretową opisaną w ćwiczeniach nr 2 (1 ml próbki badanej + 2 ml 10% NaOH + 2-3 krople 1%
roztworu CuSO

4

).

2. WYKRYWANIE PENTOZ

a) PRÓBA TOLLENSA ( Z FLOROGLUCYNĄ)
Wykonanie:

Do 2 probówek pobrać otrzymane DNA i RNA, dodać po 1ml

stężonego HCl i po 1 ml

floroglucyny i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej. W obu przypadkach powstaje czerwony
produkt kondensacji.
b) PRÓBA BIALA
Wykonanie:

Do 2 probówek pobrać otrzymane DNA i RNA, dodać 2 ml

0,2% roztworu orcyny w 20%

roztworze HCl i dodać kroplę 1% roztworu FeCl

3

. Ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej 5-10

minut. W obecności pentoz tworzy się barwa zielona.

3. ODRÓŻNIENIE DNA OD RNA – REAKCJA DISCHEGO
Wykonanie:

Do probówek z DNA i RNA dodać po 3 ml 0,4% NaOH i dokładnie rozgnieść bagietką

(szczególnie DNA), przesączyć. Do 1 ml przesączu wprowadzić 2 ml odczynnika dwufenyloaminy.
Zawartość probówek ogrzewać przez 10 minut we wrzącej łaźni wodnej. W przypadku DNA
powstaje barwa niebieska, w przypadku RNA reakcja jest negatywna.

4. WYKRYWANIE ZASAD PURYNOWYCH

Wynik dodatni dają tylko wolne zasady purynowe dlatego najpierw należy przeprowadzić

hydrolizę otrzymanych kwasów nukleinowych. W próbie z AgNO

3

czynnikiem hydrolizującym

łańcuchy DNA i RNA jest 5% H

2

SO

4

, zaś w reakcji mureksydowej stężony HNO

3

.

a) PRÓBA Z AgNO

3

Wykonanie:

Do probówek z DNA i RNA dodać po 5 ml

5% H

2

SO

4

i ogrzewać 30 minut na wrzącej

łaźni wodnej. Zobojętnić stężonym amoniakiem wobec czerwieni metylowej i odsączyć
przez bibułę do innej probówki. Do przesączu dodać kilka kropli 10% AgNO

3

. Tworzy się

biały osad kompleksu puryn ze srebrem.
b) PRÓBA MUREKSYDOWA
Wykonanie:

DNA i RNA umieścić w parowniczkach, zadać kilkoma kroplami stężonego HNO

3

i

odparować do sucha. Pozostałość zwilżyć kilkoma kroplami amoniaku w obecności zasad
purynowych pojawia się czerwone zabarwienie purpuranu amonu (mureksydu).

5. WYKRYWANIE KWASU ORTOFOSFOROWEGO

Dla wykazania obecności kwasu ortofosforowego w cząsteczkach nukleotydów tworzących

DNA i RNA niezbędnym jest przeprowadzenie uprzedniej hydrolizy tych makrocząsteczek. W
proponowanym doświadczeniu czynnikiem hydrolizującym jest 0,5 M roztwór HCl.

Wykonanie: Do probówek z DNA i RNA dodać po 0,3 ml 0,5 M HCl i po przykryciu probówek
korkami plastikowzmi ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 15 minut. Po oziębieniu dodać 1 ml

odczynnika molibdenowego i 1 ml reduktora. Probówki wstawić na chwilę do wrzącej łaźni
wodnej. Obserwować tworzenie się niebieskiego kompleksu fosforowo-molibdenowego.

Ostatnie zmiany: 13.02.2013