ZAKŁAD OPAKOWALNICTWA I BIOPOLIMERÓW

CHEMIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenia laboratoryjne nr 1

Wyodrębnianie i badanie właściwości fizyko-chemicznych białek

Artur Bartkowiak, Szczecin 2003

Ćwiczenie 1

1. Izolacja białek występujących w mleku

Białka mleka dzieli się ze względu na ich budowę, rolę biologiczną i właściwości funkcjonalne na

kazeiny, białka serwatki oraz białka otoczki kuleczek tłuszczowych.. Najważniejsze znaczenie

zarówno odżywcze jak i przemysłowe mają kazeiny i białka serwatki.

Frakcje Udział w masie

[%]

Punkt izoelektryczny

Masa cząsteczkowa

tys. [g/mol]

Kazeiny 78-85 4,6

Białka serwatki

α-laktoalbumina

β-laktoglobulina

15-25

5,1

5,3

14,2

18,3

Kazeiny są heterogeniczną grupą fosfoprotein, złożoną z 20 składników. Różnią się one składem

aminokwasowym oraz stopniem ufosforylowania i glikolizacji. Kazeiny strącają się z surowego,

odtłuszczonego mleka w temperaturze pokojowej przy pH 4,6. Podwyższenie pH do 6,7 powoduje

rozpuszczenie osadu.

Opis ćwiczenia

Dokładnie odważone 5 g odtłuszczonego mleka w proszku rozpuścić w 20 cm

3

ciepłej wody

destylowanej (w 100 cm

3

zlewce) lub 20 cm

3

zwykłego mleka. Zlewkę umieścić na kilka minut w

łaźni wodnej i doprowadzić temperaturę roztworu do 55ºC (temperatura nie może być wyższa niż

60ºC).

Przy ciągłym mieszaniu za pomocą bagietki dodawać stopniowo 10% wodny roztwór kwasu

octowego (nie dodawać kwasu zbyt gwałtownie). Kontynuować dodawanie kwasu (całkowita ilość

nie powinna przekroczyć 2 cm

3

) do momentu gdy kazeina przestanie się wytrącać a roztwór jest

zupełnie przezroczysty. Wszystkie operacje powinny być wykonane możliwie szybko tak aby

wytrącanie kazeiny była prowadzono w stałej temperaturze.

Istotne jest, aby dodać tylko taką ilość kwasu, która jest niezbędna do wytrącania kazeiny.

Gwałtowne obniżenie pH może doprowadzić do hydrolizy laktozy zawartej w pozostałym roztworze

(UWAGA: w sprawozdaniu przedstawić wzorami chemicznymi przebieg procesu hydrolizy laktozy

2

- jaki substancje otrzyma się w wyniku tej reakcji?). Roztwór mieszać do momentu gdy wytrącona

kazeiny utworzy na dnie bezpostaciową masę.

Klarowny roztwór A znad osadu przelać do innej zlewki (oznaczyć jego objętość i zachować do

analizy na zawartość białek i laktozy metodą Libermanna i Wöhlkego).

Wydziel pozostałą kazeinę na sączku celulozowym – filtracja próżniowa w lejku Büchnera

(wyciśnij możliwie dużo wody poprzez ugniatanie bagietką). Umieścić wydzieloną kazeinę w

zlewce 100 m i dodać 5 cm

3

mieszaniny (eter etylowy – metanol 1/1 wag.– UWAGA – substancja

łatwopalna – nie dopuścić do kontaktu z płomieniem) – całość mieszać bagietką przez kilka minut

po czym ciecz zdekantować i powtórzyć proces z nową porcją mieszaniny rozpuszczalników

organicznych. Poprzez przemywanie taką mieszaniną eterowo-metanolową usuwa się pozostałości

tłuszczu. Następnie należy kazeinę odfiltrować na lejku Büchnera a otrzymane białko osuszyć

między kartkami bibuły (10-15 min). Poczym całość wysuszyć w suszarce w temperaturze 40

ºC

(45-60 min).

Reakcja Liebermanna

Zasada: Reakcja ta jest charakterystyczna dla glikoprotein. W czasie ogrzewania ze stężonym

roztworem HCl następuje hydroliza białka, a jednocześnie z cukrów powstają pochodne

furfuralowe, które z fenolami, uwolnionymi w czasie hydrolizy, dają fioletowo zabarwione

połączenia

Wykonanie: Do 1 cm

3

roztworu A znad osadu kazeiny umieszczonego w probówce dodać 3 cm

3

stężonego HCI i ogrzewać przez kilka minut (w łaźni wodnej). Podobne doświadczenie wykonać dla

1% wodnego roztwory oczyszczonych protein serwatkowych (samodzielnie przygotować roztwór

takiej proteiny - znajduje się ona w odczynnikach przeznaczonych do tego ćwiczenia.

Próba Wöhlkego

Zasada: W czasie ogrzewania roztworu laktozy (albo maltozy) z amoniakiem w obecności KOH

powstaje czerwone zabarwienie (glukoza i fruktoza dają zabarwienie żółtobrązowe).

Wykonanie: Do 2 cm

3

roztworu badanego A (znad osadu kazeiny) dodać równą objętość stężonego

roztworu amoniaku i 2 krople 3% roztworu KOH. Wstawić do wrzącej łaźni wodnej na kilka minut.

Obserwować powstałe zabarwienie.

3

Ćwiczenie 1.2. Oznaczanie punktu izoelektrycznego pI kazeiny

W metodzie tej wykorzystuje się najmniejszą rozpuszczalność kazeiny w punkcie izoelektrycznym.

Odpowiednio dobierając stężenia CH

3

COOH i CH

3

COONa przygotowuje się szereg probówek z

roztworami o różnych wartościach pH. Dodaje się do nich jednakową ilość kazeiny. Wartość pH w

probówce, w której wystąpi najobfitszy osad, odpowiada pI kazeiny. Przygotowanie roztworu

kazeiny: Do kolbki miarowej (50 cm

3

) odważyć 0,25 g kazeiny i dodać 25 cm

3

wody (ogrzanej do

40°C) oraz 5 cm

3

1 M roztworu NaOH. Mieszać aż do rozpuszczenia się kazeiny, po czym

wprowadzić 5 cm

3

1 M roztworu CH

3

COOH i uzupełnić do kreski wodą. Otrzymuje się w ten

sposób lekko opalizujący roztwór kazeiny w 0,1 M roztworze CH

3

COONa.

Opis ćwiczenia

Przygotować 9 suchych probówek. Do pierwszej odmierzyć 3,2 cm

3

1 M roztworu CH

3

COOH i 6,8

cm

3

wody, a do następnych ośmiu po 5 cm

3

H

2

O. Po dokładnym wymieszaniu zawartości w

probówce pierwszej, przenieść z niej 5 cm

3

do drugiej, a z tej, po wymieszaniu, 5 cm

3

do trzeciej itd.

Do każdej probówki dodać po 1 cm

3

roztworu kazeiny i wymieszać. Obserwować roztwory

natychmiast po zmieszaniu i po 30 min. Wynik wpisać do tabelki:

Nr

probówki 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 M CH

3

COOH cm

3

1,6 0,8 0,4 0,2 0,1 0,05

0,025

0,012

0,006

pH

roztworu 3,5 3,8 4,1 4,4 4,7 5,0 5,3 5,6 5,9

zmętnienie

osad

4

Ćwiczenie 1.3. Strącanie białka za pomocą kationów (solami metali ciężkich)

Do doświadczeń zastosować kolejne roztwory z probówek z ćwiczenia 1.2. (po jego zakończeniu),

które powinny być uprzednio rozdzielone na 2 części tak aby odpowiednio były odpowiednio

roztwory do wykonania ćwiczenia zgodnie z opisem w części a i b.

a) Do 2,5 cm

3

roztworu kazeiny z każdej z próbówki 1-10 dodać parę kropli 1% roztworu

FeCI

3

. Opisać zmiany w każdym z roztworów w zależności od pH. Z czego wynikają

zaobserwowane różnice (kiedy następuje najobfitsze strącanie białka a kiedy nie)?

b) Do 2,5 cm

3

roztworu kazeiny z każdej z próbówki 1-10 dodać parę kropli 1% roztworu

CuSO

4

. Opisać zmiany w każdym z roztworów w zależności od pH. Następnie dodać po 2-3

krople roztworu 1 M NaOH. Z czego wynikają zaobserwowane różnice (kiedy następuje

najobfitsze strącanie białka a kiedy nie)?

Ćwiczenie 1.4. Cieplna denaturacja i koagulacja białka
Denaturacja białek

Terminem tym obejmuje się zmiany w konformacji łańcucha polipeptydowego, wskutek których

białko traci rodzime właściwości. Denaturacja następuje wówczas, kiedy pod wpływem czynników

fizycznych lub chemicznych ulega zniekształceniu lub zniszczeniu struktura IV, III lub II rzędu, tj.

kiedy dochodzi do zdeformowania ukształtowania cząsteczki, swoistego dla każdego białka, bez

hydrolitycznej de- gradacji łańcucha polipeptydowego. Czynniki denaturujące działają na wiązania,

które stabilizują przestrzenną strukturę białek.

Do wiązań tych należy zaliczyć przede wszystkim wiązania wodorowe tworzące się między

grupami =CO i =NH wiązań peptydowych (w tym samym lub różnych łańcuchach

polipeptydowych), a także między grupami funkcyjnymi łań- cuchów bocznych, takimi jak: -

COOH, -OH, -NH2 i -SH. W utrzymaniu konformacji cząsteczki białka współdziałają również

wiązania jonowe, powstające między grupami -COO- i -NR j, a także oddziaływania hydrofobowe

między aminokwasami niepolarnymi. Ważnym czynnikiem stabilizującym konformację łań-

cuchów polipeptydowych są kowalencyjne wiązania dwusiarczkowe, tworzące się między resztami

cysteiny tego samego lub różnych łańcuchów polipeptydowych. Istotną rolę odgrywają ponadto

metale, łączące ze sobą łańcuchy boczne aminokwasów wiązaniami koordynacyjnymi.

5

W wyniku rozerwania wiązań stabilizujących strukturę białka, uwolnione grupy funkcyjne

aminokwasów mogą wytworzyć inne wiązania, które zmienią konfigurację cząsteczki. Taka nowa,

zdenaturowana cząsteczka odznacza się zawsze zmianą, a nawet utratą właściwości biologicznych

(enzymatycznych, antygenowych, hormonalnych), a niekiedy zmianie ulegają również jej

właściwości fizykochemiczne. Denaturacji nie należy utożsamiać z koagulacją, ponieważ zjawisko

wypadania osadu nie jest nieodłącznie związane z denaturacją. Wiele białek ulega denaturacji

pozostając w roztworze. Można natomiast wytrącić białko z roztworu nie powodując jego

denaturacji (np. wysalanie).

Białko zdenaturowane w pH różnym od pI, czyli w form1e anionowej lub kationowej, utrzymuje się

w roztworze, gdyż stabilizuje je ładunek 'elektryczny. Dodanie elektrolitu, powodujące

"rozbrojenie" zawiesiny zdenaturowanego białka, prowadzi do strątu w postaci kłaczków

(flokulacja). Podczas denaturacji białka w pI tworzy się natychmiast strąt (koagulacja).

Nieodwracalny na ogół proces denaturacji może w pewnych wypadkach ulec cofnięciu, gdy np.

czynnik denaturujący działał krótko i nie spowodował daleko posuniętych zmian w strukturze

cząsteczki białka.

Denaturację białka wywołują niektóre czynniki fizyczne takie jak: ogrzewanie, wysychanie,

ultradźwięki, promieniowanie krótkofalowe i wstrząsanie .wodnych roztworów białka w atmosferze

powietrza. Chemiczne czynniki denaturujące to: kwasy, zasady, jony metali ciężkich,

chlorowodorek guanidyny, mocznik, detergenty, fenol, chloroform, rozpuszczalniki mieszające się z

wodą, jak: alkohol, aceton. Mocznik i chlorowodorek guanidyny powodują wybiórcze zrywanie

wiązań wodorowych w cząsteczce białka, a same łącząc się z uwolnionymi wiązaniami

peptydowymi za pomocą nowych wiązań wodorowych zmienia rodzimą strukturę molekularna

białka. Ciepło, powodując zrywanie wiązań wodorowych w cząsteczkach, prowadzi do

nieodwracalnej denaturacji białek. Proces denaturacji cieplnej rozpoczyna się dla różnych białek w

różnych temperaturach (między 40 a 100°C). Tylko nieliczne białka wytrzymują krótkie gotowanie

(np. żelatyna, rybonukleaza). Białko zdenaturowane w pI jest nierozpuszczalne.

Opis ćwiczenia

Do probówek odmierzyć po 2 cm

3

l % roztworu białka jaja kurzego i dodać kolejno: do pierwszej

probówki 0,2 cm

3

0,01 M roztworu HCl (pH 3), do drugiej 0,2 cm

3

buforu octanowego o pH 4,7, do

trzeciej 0,2 cm

3

0,01 M roztworu NaOH (pH 11). Wstawić wszystkie probówki do wrzącej łaźni

wodnej na 15 min. Oziębić. Zaobserwować wynik doświadczenia. Do probówek 1 i 3 dodać po 2

cm

3

0,01 M buforu octanowego o pH 4,7.

6

SPRAWOZDANIE Z ĆWICZENIA NR 1

Wyodrębnianie i badanie właściwości fizyko-chemicznych białek

Ćwiczenie 1. Izolacja białek występujących w mleku

a) przebieg hydrolizy laktozy (wzory strukturalne i sumaryczne)

b) określić zawartość % wag. strąconej kazeiny w mleku

masa otrzymana- ………g

Substancja Zawartość teoretyczna [%]

Zawartość oznaczona [%]

Kazeiny 21

?

Białka serwatkowe

4,8

-

Laktoza 36,5

-

Otrzymany wynik porównać z zawartością teoretyczną (Z.Sikorski, Chemia Żywności, WNT

2000) i skomentuj prawdopodobne powody otrzymanej różnicy

•

•

•

c) próba Liebermanna i Wöhlkego

Czy zaobserwowano jakieś różnice w przypadku dwóch roztworów badanych w próbie

Liebermanna?

Z czego wynikają zmiany barwy zachodzące podczas ogrzewania a z czego ich brak -

przedyskutować?

7

Ćwiczenie 2. Oznaczanie punktu izoelektrycznego pI kazeiny

Nr

probówki 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 M CH

3

COOH cm

3

1,6 0,8 0,4 0,2 0,1 0,05

0,025

0,012

0,006

pH

roztworu 3,5 3,8 4,1 4,4 4,7 5,0 5,3 5,6 5,9

zmętnienie

osad

Ćwiczenie 3. Strącanie białka za pomocą kationów (solami metali ciężkich)

Zastanowić, co prawdopodobnie będzie można zaobserwować, gdyby zamiast kationów

wielowartościowych zastosować aniony wielowartościowe?

•

•

•

Czy były by jakieś różnice i jaki ma to związek z punktem pI określonego białka?

Opisać takie zachowanie odpowiednimi uproszczonymi reakcjami chemicznymi

Ćwiczenie 4. Cieplna denaturacja i koagulacja białka

Czynniki denaturujące białko:

Wysalanie białka to………………

Suma punktów ………

8

9