ĆWICZEIE 9: CHROMATOGRAFIA

Chromatografia

1

Chromatografia polega na rozdzielaniu mieszanin których składniki ulegają podziałowi

pomiędzy dwie fazy - stacjonarną i ruchomą, przenikające się wzajemnie i stykające

możliwie na dużej powierzchni. Fazą ruchomą jest ciecz (chromatografia cieczowa) lub gaz

(chromatografia gazowa).

Hydrodynamiczny przepływ fazy ruchomej powoduje migrację składników mieszaniny. Podział

składników pomiędzy fazami jest przyczyną zróżnicowanego opóźnienia ich ruchu, a przebyta

droga zależy od czasu przebywania danego składnika w fazie ruchomej. Odrębność faz

spowodowana jest różnicą ich polarności - stacjonarna posiada zwykle większą polarność

2

.

Fazę stacjonarną mogą tworzyć:

-

adsorbenty w postaci ziaren lub włókien żelu;

-

adsorbenty w postaci ziaren substancji krystalicznej;

-

ciecz osadzona na ziarnach lub włóknach nośnika stałego.

Adsorbenty nie mogą reagować z rozdzielanymi substancjami ani wykazywać właściwości

katalitycznych powodujących np.: utlenianie, izomeryzację lub polimeryzację badanych

związków, muszą posiadać odpowiedni stopień rozdrobnienia (ziarna możliwie tej samej

wielkości), odpowiednią powierzchnię właściwą oraz odpowiednią średnicę porów. Ponadto

absorbenty muszą być selektywne, tzn. wykazywać różne powinowactwo do rozdzielanych

substancji. Do najczęściej stosowanych adsorbentów należą: wspomniany już żel

krzemionkowy, Al

2

O

3

, ziemia okrzemkowa, celuloza, żel akrylowy lub poliestrowy, poliamidy.

ośniki fazy stacjonarnej nie mogą wykazywać właściwości adsorpcyjnych w stosunku do

rozdzielanych substancji ani wchodzić z nimi w reakcję.

W zależności od charakteru procesów hamujących selektywnie migrację rozdzielanych

1

Termin „chromatografia" zaproponowany został przez rosyjskiego badacza M. S. Cwieta (greckie: chroma - kolor,

graphtein - rysować, pisać). Cwiet zajmował się rozdziałem barwników izolowanych z liści roślin, przy użyciu
kolumny szklanej wypełnionej adsorbentem w postaci CaCO

3

. Rok 1903, w którym Cwiet ogłosił pierwsze wyniki

swoich badań uważa się za oficjalny rok odkrycia metody chromatograficznej.

2

Obecnie coraz częściej stosuje się układ odwróconych faz (reversed phase chromatography), w którym faza ruchoma

jest bardziej polarna od fazy nieruchomej.

składników mieszaniny rozróżniamy:

1. Chromatografię podziałową - dyfuzja cząsteczek do cieczy stacjonarnej;

2. Chromatografię adsorpcyjną - adsorpcja fizyczna na powierzchni adsorbentu;

3. Filtrację żelową - dyfuzja do żelu;

4. Chromatografię jonowymienną - dyfuzja do jonitu.

Chromatografia podziałowa

Fazę stacjonarną stanowi silnie polarna ciecz (np. H

2

O), formamid lub kwas octowy),

zawieszona na nośniku (np.: żel krzemionkowy, celuloza, poliamid). Fazę ruchomą może

stanowić gaz lub ciecz (eluent) mniej polarna od rozpuszczalnika tworzącego fazę nieruchomą

(np.: benzen, fenol, trichlorometan). Składniki mieszaniny ulegają rozdzieleniu na zasadzie

różnej rozpuszczalności w obu fazach. Migracja hamowana jest przez fazę stacjonarną na

drodze złożonego oddziaływania o charakterze dyfuzji, osmozy, asocjacji lub dysocjacji cząstek

o budowie polarnej. Mogą w nim mieć również udział siły van der Waals'a.

Chromatografia adsorpcyjna

Fazę stacjonarną stanowi stały adsorbent o silnie rozwiniętej powierzchni. Fazę ruchomą

ciecz lub gaz. Rozdział oparty jest na różnym powinowactwie składników mieszaniny do

adsorbenta. Migrację hamuje zróżnicowana adsorpcja na jego powierzchni. Oddziaływanie to

może mieć różny charakter, np. „mostków wodorowych” lub odpowiednich kompleksów. Na

rycinie przedstawione jest chwilowe unieruchomienie cząstek pirydyny na powierzchni żelu

krzemionkowego przez utworzenie takiego H-mostka pomiędzy zasadowym atomem azotu i

powierzchniową grupą hydroksylową.

Filtracja żelowa

Fazę stacjonarny stanowi ciecz wypełniająca żel o regularnej

3

strukturze posiadający określone

rozmiary „oczek” w sieci przestrzennej. Fazę ruchomą stanowi ciecz. W najprostszym

przypadku rozdział oparty jest na dyfuzji cząstek składników mieszaniny w głąb ziaren żelu. Im

mniejsze są te cząsteczki, tym swobodniej dyfundują i tym dłuższy czas przebywają w fazie

stacjonarnej, co różnicuje szybkości ich migracji. Cząsteczki duże (większe od „oczek sita”)

dyfundować nie mogą, przebywają wyłącznie w fazie ruchomej wędrując z czołem

rozpuszczalnika.

Chromatografia jonowymienna

Fazę stacjonarną stanowi ciecz zawarta w sieci przestrzennej jonitu

4

- występującego

przeważnie w postaci żelu.

Fazę ruchomą stanowi ciecz przepływająca pomiędzy ziarnami jonitu. Rozdział oparty jest na

wymianie składników mieszaniny o charakterze jonowym z jonami jonitu. Jony (np. Na

+

)

dyfundują do żelu uwalniając równoważną ilość jonów o tym samym znaku (np. H

+

). Czynnikiem

różnicującym migrację jest oddziaływanie elektrostatyczne rozdzielanych cząstek z fazą ruchomą i

stacjonarną, pH roztworu i temperatura.

3

Żele o właściwościach tzw. „sit molekularnych". Zaliczamy do nich sefadeks (dekstran), żele akrylowe.

4

Jonity - substancje głównie syntetyczne, otrzymywane przez polikondensację fenoli lub amin aromatycznych z

metanalem (formaldehydem). Tworzą przestrzennie usieciowane układy wielkocząsteczkowe, trudno rozpuszczalne w

wodzie, zawierające liczne hydrofilowe grupy funkcyjne. Rozróżniamy:

Kationity - służące do wymiany kationów, zawierają grupy o charakterze kwasowym (np. sulfonowe, karboksylowe):

Amonity - służące do wymiany anionów, zawierające grupy o charakterze zasadowym (np. aminowe).

Przedstawiona klasyfikacja procesów chromatograficznych nie jest jednoznaczna. Bardzo często

mogą tutaj występować mechanizmy mieszane. Np. w chromatografii na żelu krzemionkowym

obok mechanizmu adsorpcyjncgo może występować mechanizm podziałowy (z chwilą kiedy na

żelu zostanie zaadsorbowana odpowiednia ilość wody). Natomiast w typowej

chromatografii

podziałowej może występować mechanizm adsorpcyjny spowodowany adsorpcją rozdzielanych

składników na nośniku fazy stacjonarnej lub na powierzchni odgraniczającej fazy ciekle.

Utworzenie odpowiedniego układu chromatograficznego można zrealizować stosując technikę

kolumnową, bibułową lub cienkowarstwową.

Technika kolumnowa

Kolumnę chromatograficzną sporządza się wypełniając rurę szklaną lub plastikową odpowiednią

substancją, która sama stanowi fazę stacjonarną bądź też jest nośnikiem - jeżeli fazę stacjonarną

stanowi ciecz.

Technika bibułowa.

Proces rozdziału przeprowadza się na specjalnie spreparowanej bibule, która spełnia rolę nośnika

obu faz.

Technika cienkowarstwowa (TLC; ang. thin layer chromatography)

Powszechnie obecnie stosowana, łączy w sobie zalety techniki kolumnowej i bibułowej.

Układ stanowi płytka wykonana ze szkła lub odpowiedniej folii pokryta cienką warstwą

substancji spełniającej podobnie jak w kolumnie albo funkcję fazy stacjonarnej albo nośnika

tej fazy. Bez względu na stosowaną technikę analizowaną mieszaninę nanosi się na początek

fazy stacjonarnej („miejsce” lub „linia startu’'), wzdłuż której odbywa się migracja fazy

ruchomej (ryc.5).

Składniki mieszaniny migrują z fazą ruchomą z różną szybkością, co powoduje ich rozdział w

postaci pasm lub plam na chromatogramie. Proces migracji fazy ruchomej nazywamy

rozwijaniem chromatogramu. Miejsce zatrzymania fazy ruchomej po zakończeniu procesu

chromatograficznego nazywamy „czołem rozpuszczalnika” lub „linią mety”.

Niezależnie od metody chromatograficznej (adsorpcyjna, podziałowa itd.) mechanizm

różnicowania szybkości migracji cząsteczek mieszaniny prowadzący do rozdzielenia pasm

(plam) jest taki sam. Cząsteczki danego składnika przebywają pewien określony czas w fazie

ruchomej. Czas ten wyznacza drogę przebytą przez pasmo tego składnika. Można to

zilustrować na przykładzie chromatografii podziałowej w układzie ciecz - ciecz. (ryc.6).

Podział chromatograficznego składnika zależy od stosunku jego rozpuszczalności w obu

cieczach (fazach). Wyróżnić tu można trzy przypadki:

1.

Cząsteczki składnika trudno rozpuszczalnego w fazie ruchomej, a dobrze w fazie stacjonarnej,

cały czas przebywają w fazie stacjonarnej i pozostają na linii startu;

2.

Cząsteczki składnika trudno rozpuszczalnego w fazie stacjonarnej, a dobrze w fazie ruchomej

przebywają cały czas tym razem w fazie ruchomej i migrują w układzie z szybkością

równą szybkości tej fazy;

3.

Składnik rozdzielanej mieszaniny jest dobrze rozpuszczalny w obu fazach. Wtedy jego

cząsteczki przebywają połowę czasu w fazie ruchomej migrując i połowę w fazie

nieruchomej - spoczywając. Ponieważ przebyta droga jest proporcjonalna do czasu migracji,

który w tym przypadku dla każdej cząsteczki jest dwukrotnie mniejszy od czasu rozwijania

chromatogramu na dystansie: linia startu - linia mety, droga przebyta przez pasmo trzeciego

składnika wyniesie połowę drogi przebytej przez składnik drugi (dobrze rozpuszczalny w

fazie ruchomej).

Np. jeżeli czas rozwijania chromatogramu na dystansie start - meta równym 20 cm wynosi 30

minut to:

- cząsteczki pierwszego składnika rozdzielanej mieszaniny migrują przez 0 minut i pozostają na

linii startu;

- cząsteczki drugiego składnika migrują przez 30 minut i znajdują się na linii mety;

- cząsteczki trzeciego składnika migrują przez 15 minut i znajdują się na środku

chromatogramu.

Podział składników pomiędzy dwie fazy charakteryzuje ilościowo prawo podziału ernsta,

zgodnie z którym: w stanie równowagi stosunek stężeń substancji w obu fazach jest

wielkością stałą. Stała ta nosi nazwę współczynnika podziału ernsta.

2

1

C

C

k =

k - współczynnik podziału
C

1

- stężenie składników w fazie stacjonarnej

C

2

- stężenie składników w fazie ruchomej

Stężenia C

1

i C

2

określają zawartość składników w jednakowych objętościach obu faz.

Celem identyfikacji substancji w chromatografii bibułowej i cienkowarstwowej stosowany jest tzw.

współczynnik retencji R

F

.

Praktycznie R

F

wyznaczamy z zależności:

odległość środka plamy od startu (cm)
R

F

=

odległość czoła rozpuszczalnika od startu (cm)

stąd:

R

F

dla składnika X

1

a

b

R

F

=

R

F

dla składnika X

2

a

c

R

F

=

Wartość liczbowa współczynnika R

F

zależy od szeregu czynników, jak temperatura, ilość i

rodzaj substancji chromatografowanej, układ rozpuszczalników w obu fazach, długość drogi

migracji i innych. Na ogół wyznaczanie R

F

jest kłopotliwe i wymaga bardzo starannego

postępowania. Błąd oznaczenia nie może przekraczać 2%.

R

F

może służyć do identyfikacji rozdzielanych składników mieszaniny. Należy jednak pamiętać,

że porównywanie znalezionych doświadczalnie współczynników R

F

ze współczynnikami

podawanymi w specjalnych tabelach lub innych pracach nie jest zawsze możliwe. Wartości R

F

można uważać za przybliżone stale tylko przy zachowaniu identycznych warunków procesów

chromatograficznych, stosowanych dla substancji badanej i wzorcowej.

Dlatego też najczęściej przy identyfikacji posługuje się chromatogramami wzorcowymi, tzw.

„mapkami''.

Na układ chromatograficzny obok badanej mieszaniny nanosi się substancje wzorcowe (np.

poszczególne aminokwasy). Po rozwinięciu chromatogramu porównuje się bezpośrednio

współczynniki R

F

rozdzielanych składników z odpowiednimi współczynnikami wzorców

(ryc.8)

Rozdział mieszaniny α-aminokwasów metodą chromatografii cienkowarstwowej.

Chromatografia cienkowarstwowa jest aktualnie najczęściej stosowaną metodą rozdziału

mieszanin

oraz

otrzymywania

i

oczyszczania

związków

chemicznych

na

skalę

mikropreparatywną. Zaletami jej są między innymi:

-

stosunkowo duża szybkość rozwijania chromatogramu;

-

możliwość stosowania szerokiego wachlarza rozpuszczalników oraz ich minimalne

zużycie;

-

możliwość detekcji rozdzielonych związków przy użyciu wielorakich metod fizycznych i

chemicznych;

Układ chromatograficzny stanowi płytka z naniesionymi próbkami, umieszczona w

odpowiedniej komorze tak aby warstwa adsorbentu lub nośnika kontaktowała się z

rozpuszczalnikiem od linii startu. W użyciu znajdują się różne typy komór (pionowe lub

poziome - zależnie od ułożenia płytek), wykonanych ze szkła lub odpowiednich tworzyw

sztucznych, o wielkości (objętości) dostosowanej do wielkości płytek.

Metodą chromatograficzną można rozdzielać zarówno mieszaniny substancji barwnych jak i

bezbarwnych. W drugim przypadku wymaga to jednak dodatkowych czynności związanych z

lokalizacją poszczególnych składników po rozwinięciu chromatogramu. Istnieją tu dwie

możliwości:

-

składniki mieszaniny przeprowadza się w barwne pochodne, a następnie dokonuje podziału.

Na chromatogramie widoczne są od razu barwne plamy (pasma);

-

mieszaninę rozdziela się, a następnie przeprowadza barwne reakcje z odpowiednimi

odczynnikami (wywoływanie chromatogramu). Powstałe barwne plamy (pasma) na

chromatogramie pozwalają na lokalizację składników.

Jako przykład pierwszego rozwiązania może służyć reakcja aminokwasów z 1-fluoro-2,4-

dinitrobenzenem, wprowadzona przez Sangera w roku 1945. która pozwoliła na ustalenie

sekwencji aminokwasów w insulinie (pierwszy przypadek ustalenia sekwencji aminokwasów).

Związek ten reaguje z wolnymi, pierwszorzędowymi grupami aminowymi. Umożliwia to

obserwację migracji poszczególnych składników w czasie rozwijania chromatogramów oraz

ich końcową lokalizację.

Przykładem wywoływania chromatogramu po rozwinięciu może być reakcja z ninhydryną,

która w reakcji z aminokwasami tworzy różowofioletowe połączenia. Prolina i

hydroksyprolina dają połączenia żółte. Jest to bardzo czuła reakcja pozwalająca na

wykrywanie mikrogramowych ilości aminokwasów, nawet w odcisku palca.

Rozdział wolnych aminokwasów

Wykonanie ćwiczenia.

1. Na płytce chromatograficznej zaznaczamy delikatnie przy pomocy linijki i

ołówka

grafitowego (zwykłego) linię startową w odległości 1 cm od krawędzi.

2. Mikropipetą nanosimy niewielką ilość oznaczanej mieszaniny aminokwasów oraz

aminokwasy wzorcowe. Miejsce nakroplenia suszymy suszarką ręczną lub promiennikiem

podczerwieni.

3. Płytkę umieszczamy w komorze zawierającej odpowiedni układ rozpuszczalników i po

wypoziomowaniu

komory

przesuwamy

w

kierunku

pokrywy

zbiornika

eluentu

(doprowadzenie do kontaktu warstwy adsorbentu z rozpuszczalnikiem). Komorę

przykrywamy.

4. Rozwinięty chromatogram suszymy pod wyciągiem, zanurzamy na kilka sekund w 0,1%

roztworze ninhydryny w acetonie i ponownie suszymy. Pojawiają się różowofioletowe lub

żółte plamki rozdzielanych składników.

5. Mierzymy współczynniki R

F

i identyfikujemy aminokwasy.

Mieszaninę aminokwasów i aminokwasy wzorcowe, układ rozpuszczalników oraz czas

rozwijania chromatogramu podaje prowadzący ćwiczenia.