ĆWICZEIE 9: CHROMATOGRAFIA 

 

Chromatografia

1

 

 

Chromatografia polega na rozdzielaniu mieszanin których składniki ulegają podziałowi 

pomiędzy dwie fazy - stacjonarną  i ruchomą, przenikające się wzajemnie i stykające 

możliwie na dużej powierzchni. Fazą ruchomą jest ciecz (chromatografia cieczowa) lub gaz 

(chromatografia gazowa). 

 

Hydrodynamiczny przepływ fazy ruchomej powoduje migrację składników mieszaniny. Podział 

składników pomiędzy fazami jest przyczyną zróżnicowanego opóźnienia ich ruchu, a przebyta 

droga zależy od czasu przebywania danego składnika w fazie ruchomej. Odrębność faz 

spowodowana jest różnicą ich polarności - stacjonarna posiada zwykle większą polarność

2

. 

 

 

Fazę stacjonarną mogą tworzyć: 

- 

adsorbenty w postaci ziaren lub włókien żelu; 

- 

adsorbenty w postaci ziaren substancji krystalicznej; 

- 

ciecz osadzona na ziarnach lub włóknach nośnika stałego. 

 

Adsorbenty nie mogą reagować z rozdzielanymi substancjami ani wykazywać właściwości 

katalitycznych  powodujących  np.:  utlenianie,  izomeryzację  lub  polimeryzację  badanych 

związków,  muszą  posiadać  odpowiedni  stopień  rozdrobnienia  (ziarna  możliwie  tej  samej 

wielkości),  odpowiednią  powierzchnię  właściwą  oraz  odpowiednią  średnicę  porów.  Ponadto 

absorbenty muszą być selektywne, tzn. wykazywać różne powinowactwo do rozdzielanych 

substancji.  Do  najczęściej  stosowanych  adsorbentów  należą:  wspomniany  już  żel 

krzemionkowy, Al

2

O

3

, ziemia okrzemkowa, celuloza, żel akrylowy lub poliestrowy, poliamidy. 

ośniki fazy stacjonarnej nie mogą wykazywać właściwości adsorpcyjnych w stosunku do 

rozdzielanych substancji ani wchodzić z nimi w reakcję. 

W  zależności  od  charakteru  procesów  hamujących  selektywnie  migrację  rozdzielanych 

                     

1

  Termin  „chromatografia"  zaproponowany został  przez   rosyjskiego  badacza  M. S.  Cwieta  (greckie: chroma - kolor, 

graphtein  -  rysować,  pisać).  Cwiet  zajmował  się  rozdziałem  barwników  izolowanych  z  liści  roślin,  przy  użyciu 
kolumny  szklanej  wypełnionej  adsorbentem  w  postaci  CaCO

3

.  Rok  1903,  w  którym  Cwiet  ogłosił  pierwsze  wyniki 

swoich badań uważa się za oficjalny rok odkrycia metody chromatograficznej. 

2

 Obecnie coraz częściej stosuje się układ odwróconych faz (reversed phase chromatography), w którym faza ruchoma 

jest bardziej polarna od fazy nieruchomej. 

 

składników mieszaniny rozróżniamy: 

1. Chromatografię podziałową - dyfuzja cząsteczek do cieczy stacjonarnej; 

2. Chromatografię adsorpcyjną - adsorpcja fizyczna na powierzchni adsorbentu; 

3.  Filtrację żelową - dyfuzja do żelu; 

4. Chromatografię jonowymienną - dyfuzja do jonitu. 

Chromatografia podziałowa 

 

Fazę  stacjonarną  stanowi  silnie  polarna  ciecz  (np.  H

2

O),  formamid  lub  kwas  octowy), 

zawieszona  na  nośniku  (np.:  żel  krzemionkowy,  celuloza,  poliamid).  Fazę  ruchomą  może 

stanowić gaz lub ciecz (eluent) mniej polarna od rozpuszczalnika tworzącego fazę nieruchomą 

(np.:  benzen,  fenol,  trichlorometan).  Składniki  mieszaniny  ulegają  rozdzieleniu  na  zasadzie 

różnej  rozpuszczalności  w  obu  fazach.  Migracja  hamowana  jest  przez  fazę  stacjonarną  na 

drodze złożonego oddziaływania o charakterze dyfuzji, osmozy, asocjacji lub dysocjacji cząstek 

o budowie polarnej. Mogą w nim mieć również udział siły van der Waals'a. 

 

 

 

 

 

Chromatografia adsorpcyjna 

 

Fazę  stacjonarną  stanowi  stały  adsorbent  o  silnie  rozwiniętej  powierzchni.  Fazę  ruchomą 

ciecz  lub  gaz.  Rozdział  oparty  jest  na  różnym  powinowactwie  składników  mieszaniny  do 

adsorbenta.  Migrację  hamuje  zróżnicowana  adsorpcja  na  jego  powierzchni.  Oddziaływanie  to 

może  mieć  różny  charakter,  np.  „mostków  wodorowych”  lub  odpowiednich  kompleksów.  Na 

rycinie  przedstawione  jest  chwilowe  unieruchomienie  cząstek  pirydyny  na  powierzchni  żelu 

krzemionkowego  przez  utworzenie  takiego  H-mostka  pomiędzy  zasadowym  atomem  azotu  i 

powierzchniową grupą hydroksylową. 

Filtracja żelowa 

 

 

 

Fazę stacjonarny stanowi ciecz wypełniająca żel o regularnej

3

 strukturze posiadający określone 

rozmiary  „oczek”  w  sieci  przestrzennej.  Fazę  ruchomą  stanowi  ciecz.  W  najprostszym 

przypadku rozdział oparty jest na dyfuzji cząstek składników mieszaniny w głąb ziaren żelu. Im 

mniejsze  są  te  cząsteczki,  tym  swobodniej  dyfundują  i  tym  dłuższy  czas  przebywają  w  fazie 

stacjonarnej,  co  różnicuje  szybkości  ich  migracji.  Cząsteczki  duże  (większe  od  „oczek  sita”) 

dyfundować  nie  mogą,  przebywają  wyłącznie  w  fazie  ruchomej  wędrując  z  czołem 

rozpuszczalnika. 

 
Chromatografia jonowymienna 
 

Fazę  stacjonarną  stanowi  ciecz  zawarta  w  sieci  przestrzennej  jonitu

4

  -  występującego 

przeważnie w postaci żelu. 

Fazę  ruchomą  stanowi  ciecz  przepływająca  pomiędzy  ziarnami  jonitu.  Rozdział  oparty  jest  na 

wymianie  składników  mieszaniny  o  charakterze  jonowym  z  jonami  jonitu.  Jony  (np.  Na

+

) 

dyfundują do żelu uwalniając równoważną ilość jonów o tym samym znaku (np. H

+

). Czynnikiem 

różnicującym migrację jest oddziaływanie elektrostatyczne rozdzielanych cząstek z fazą ruchomą i 

stacjonarną, pH roztworu i temperatura. 

 

                     

3

 

Żele o właściwościach tzw. „sit molekularnych". Zaliczamy do nich sefadeks (dekstran), żele akrylowe. 

4

 Jonity - substancje głównie syntetyczne, otrzymywane przez polikondensację fenoli lub amin aromatycznych z 

metanalem (formaldehydem). Tworzą przestrzennie usieciowane układy wielkocząsteczkowe, trudno rozpuszczalne w 

wodzie, zawierające liczne hydrofilowe grupy funkcyjne. Rozróżniamy: 

Kationity - służące do wymiany kationów, zawierają grupy o charakterze kwasowym (np. sulfonowe, karboksylowe): 

Amonity - służące do wymiany anionów, zawierające grupy o charakterze zasadowym (np. aminowe).

 

 

Przedstawiona  klasyfikacja  procesów  chromatograficznych  nie  jest  jednoznaczna.  Bardzo  często 

mogą tutaj występować mechanizmy mieszane. Np. w chromatografii na żelu krzemionkowym 

obok mechanizmu adsorpcyjncgo może występować mechanizm podziałowy (z chwilą kiedy na 

żelu  zostanie  zaadsorbowana  odpowiednia  ilość  wody).  Natomiast  w  typowej

 

chromatografii 

podziałowej może występować mechanizm adsorpcyjny spowodowany adsorpcją rozdzielanych 

składników na nośniku fazy stacjonarnej lub na powierzchni odgraniczającej fazy ciekle. 

Utworzenie odpowiedniego układu chromatograficznego można zrealizować stosując technikę 

kolumnową, bibułową lub cienkowarstwową. 
 

Technika kolumnowa 

 

Kolumnę  chromatograficzną  sporządza  się  wypełniając  rurę  szklaną  lub  plastikową  odpowiednią 

substancją,  która  sama  stanowi  fazę  stacjonarną  bądź  też  jest  nośnikiem  -  jeżeli  fazę  stacjonarną 

stanowi ciecz. 

Technika bibułowa. 

Proces  rozdziału  przeprowadza  się  na  specjalnie  spreparowanej  bibule,  która  spełnia  rolę  nośnika 

obu faz. 

 

 

 

 

Technika cienkowarstwowa (TLC; ang. thin layer chromatography) 

Powszechnie  obecnie  stosowana,  łączy  w  sobie  zalety  techniki  kolumnowej  i  bibułowej. 

Układ  stanowi  płytka  wykonana  ze  szkła  lub  odpowiedniej  folii  pokryta  cienką  warstwą 

substancji spełniającej podobnie jak w kolumnie albo funkcję fazy stacjonarnej albo nośnika 

tej fazy. Bez względu na stosowaną technikę analizowaną mieszaninę nanosi się na początek 

fazy  stacjonarnej  („miejsce”  lub  „linia  startu’'),  wzdłuż  której  odbywa  się  migracja  fazy 

ruchomej (ryc.5). 

Składniki  mieszaniny  migrują  z  fazą  ruchomą  z  różną szybkością, co  powoduje  ich  rozdział  w 

postaci  pasm  lub  plam  na  chromatogramie.  Proces  migracji  fazy  ruchomej  nazywamy 

rozwijaniem  chromatogramu.  Miejsce  zatrzymania  fazy  ruchomej  po  zakończeniu  procesu 

chromatograficznego nazywamy „czołem rozpuszczalnika” lub „linią mety”. 

Niezależnie  od  metody  chromatograficznej  (adsorpcyjna,  podziałowa  itd.)  mechanizm 

różnicowania  szybkości  migracji  cząsteczek  mieszaniny  prowadzący  do  rozdzielenia  pasm 

(plam) jest taki sam. Cząsteczki danego składnika przebywają pewien określony czas w fazie 

ruchomej.  Czas  ten  wyznacza  drogę  przebytą  przez  pasmo  tego  składnika.  Można  to 

zilustrować na przykładzie chromatografii podziałowej w układzie ciecz - ciecz. (ryc.6). 

 

Podział  chromatograficznego  składnika  zależy  od  stosunku  jego  rozpuszczalności  w  obu 

cieczach (fazach). Wyróżnić tu można trzy przypadki: 

1. 

Cząsteczki składnika trudno rozpuszczalnego w fazie ruchomej, a dobrze w fazie stacjonarnej, 

cały czas przebywają w fazie stacjonarnej i pozostają na linii startu; 

2. 

Cząsteczki składnika trudno rozpuszczalnego w fazie stacjonarnej, a dobrze w fazie ruchomej 

przebywają  cały  czas  tym  razem  w  fazie  ruchomej  i  migrują  w  układzie  z  szybkością 

równą szybkości tej fazy; 

 

3. 

Składnik  rozdzielanej  mieszaniny  jest  dobrze  rozpuszczalny  w  obu  fazach.  Wtedy  jego 

cząsteczki  przebywają  połowę  czasu  w  fazie  ruchomej  migrując  i  połowę  w  fazie 

nieruchomej - spoczywając. Ponieważ przebyta droga jest proporcjonalna do czasu migracji, 

który  w  tym  przypadku dla  każdej  cząsteczki jest  dwukrotnie  mniejszy od  czasu rozwijania 

chromatogramu na dystansie: linia startu - linia mety, droga przebyta przez pasmo trzeciego 

składnika  wyniesie  połowę  drogi  przebytej  przez  składnik  drugi  (dobrze  rozpuszczalny  w 

fazie ruchomej). 

 

Np.  jeżeli  czas  rozwijania  chromatogramu  na  dystansie  start  -  meta  równym  20  cm  wynosi  30 

minut to: 

-  cząsteczki  pierwszego  składnika  rozdzielanej  mieszaniny  migrują  przez  0  minut  i  pozostają  na 

linii startu; 

- cząsteczki drugiego składnika migrują przez 30 minut i znajdują się na linii mety; 

-  cząsteczki  trzeciego  składnika  migrują  przez  15  minut  i  znajdują  się  na  środku 

chromatogramu. 

 

Podział  składników  pomiędzy  dwie  fazy  charakteryzuje  ilościowo  prawo  podziału  ernsta, 

zgodnie  z  którym:  w  stanie  równowagi  stosunek  stężeń  substancji  w  obu  fazach  jest 

wielkością stałą. Stała ta nosi nazwę współczynnika podziału ernsta. 

2

1

C

C

k =

 

 k - współczynnik podziału 
C

1 

- stężenie składników w fazie stacjonarnej 

C

2

 - stężenie składników w fazie ruchomej 

Stężenia C

1

 i C

2

 określają zawartość składników w jednakowych objętościach obu faz.  

 

Celem identyfikacji substancji w chromatografii bibułowej i cienkowarstwowej stosowany jest tzw. 

współczynnik retencji R

F

. 

 

 

 

 
 
 

 

Praktycznie R

F 

wyznaczamy z zależności: 

 

                                                             odległość środka plamy od startu (cm)  
                                       R

F

   = 

                                                      odległość czoła rozpuszczalnika od startu (cm) 

stąd:                                  

R

F

 dla składnika X

1

  

a

b

R

F

=

 

R

F

 dla składnika X

2

   

a

c

R

F

=

 

Wartość  liczbowa  współczynnika  R

F

  zależy  od  szeregu  czynników,  jak  temperatura,  ilość  i 

rodzaj  substancji  chromatografowanej,  układ  rozpuszczalników  w  obu  fazach,  długość  drogi 

migracji  i  innych.  Na  ogół  wyznaczanie  R

F

  jest  kłopotliwe  i  wymaga  bardzo  starannego 

postępowania. Błąd oznaczenia nie może przekraczać 2%. 

R

F

 

może służyć do identyfikacji rozdzielanych składników mieszaniny. Należy jednak pamiętać, 

że  porównywanie  znalezionych  doświadczalnie  współczynników  R

F

  ze  współczynnikami 

podawanymi  w  specjalnych  tabelach  lub  innych  pracach  nie  jest  zawsze  możliwe.  Wartości  R

F

 

można uważać za przybliżone stale tylko przy zachowaniu identycznych warunków procesów 

chromatograficznych, stosowanych dla substancji badanej i wzorcowej. 

Dlatego  też  najczęściej  przy  identyfikacji  posługuje  się  chromatogramami  wzorcowymi,  tzw. 

 

„mapkami''. 

Na  układ  chromatograficzny  obok  badanej  mieszaniny  nanosi  się  substancje  wzorcowe  (np. 

poszczególne  aminokwasy).  Po  rozwinięciu  chromatogramu  porównuje  się  bezpośrednio 

współczynniki  R

F

  rozdzielanych  składników  z  odpowiednimi  współczynnikami  wzorców 

(ryc.8)

 

 

Rozdział mieszaniny α-aminokwasów metodą chromatografii cienkowarstwowej. 

Chromatografia  cienkowarstwowa  jest  aktualnie  najczęściej  stosowaną  metodą  rozdziału 

mieszanin 

oraz 

otrzymywania 

i 

oczyszczania 

związków 

chemicznych 

na 

skalę 

mikropreparatywną. Zaletami jej są między innymi: 

- 

stosunkowo duża szybkość rozwijania chromatogramu; 

- 

możliwość  stosowania  szerokiego  wachlarza  rozpuszczalników  oraz  ich  minimalne 

zużycie; 

- 

możliwość  detekcji  rozdzielonych  związków  przy  użyciu  wielorakich  metod  fizycznych  i 

chemicznych; 

 

 

Układ  chromatograficzny  stanowi  płytka  z  naniesionymi  próbkami,  umieszczona  w 

odpowiedniej  komorze  tak  aby  warstwa  adsorbentu  lub  nośnika  kontaktowała  się  z 

rozpuszczalnikiem  od  linii  startu.  W  użyciu  znajdują  się  różne  typy  komór  (pionowe  lub 

poziome  -  zależnie  od  ułożenia  płytek),  wykonanych  ze  szkła  lub  odpowiednich  tworzyw 

sztucznych, o wielkości (objętości) dostosowanej do wielkości płytek.  

Metodą  chromatograficzną  można  rozdzielać  zarówno  mieszaniny  substancji  barwnych  jak  i 

bezbarwnych. W drugim przypadku wymaga to jednak dodatkowych czynności związanych z 

lokalizacją  poszczególnych  składników  po  rozwinięciu  chromatogramu.  Istnieją  tu  dwie 

możliwości: 

- 

składniki  mieszaniny  przeprowadza  się  w  barwne  pochodne,  a  następnie  dokonuje  podziału. 

Na chromatogramie widoczne są od razu barwne plamy (pasma); 

- 

mieszaninę  rozdziela  się,  a  następnie  przeprowadza  barwne  reakcje  z  odpowiednimi 

odczynnikami  (wywoływanie  chromatogramu).  Powstałe  barwne  plamy  (pasma)  na 

chromatogramie pozwalają na lokalizację składników. 

Jako  przykład  pierwszego  rozwiązania  może  służyć  reakcja  aminokwasów  z  1-fluoro-2,4-

dinitrobenzenem,  wprowadzona  przez  Sangera  w  roku  1945.  która  pozwoliła  na  ustalenie 

sekwencji aminokwasów w insulinie (pierwszy przypadek ustalenia sekwencji aminokwasów). 

Związek  ten  reaguje  z  wolnymi,  pierwszorzędowymi  grupami  aminowymi.  Umożliwia  to 

obserwację  migracji  poszczególnych  składników  w  czasie  rozwijania  chromatogramów  oraz 

ich końcową lokalizację.  

Przykładem  wywoływania  chromatogramu  po  rozwinięciu  może  być  reakcja  z  ninhydryną, 

która  w  reakcji  z  aminokwasami  tworzy  różowofioletowe  połączenia.  Prolina  i 

hydroksyprolina  dają  połączenia  żółte.  Jest  to  bardzo  czuła  reakcja  pozwalająca  na 

wykrywanie mikrogramowych ilości aminokwasów, nawet w odcisku palca. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Rozdział wolnych aminokwasów   

Wykonanie ćwiczenia. 

1. Na płytce chromatograficznej zaznaczamy delikatnie przy pomocy linijki i  

ołówka 

grafitowego (zwykłego) linię startową w odległości 1 cm od krawędzi. 

2.  Mikropipetą  nanosimy  niewielką  ilość  oznaczanej  mieszaniny  aminokwasów  oraz 

aminokwasy  wzorcowe.  Miejsce  nakroplenia  suszymy  suszarką  ręczną  lub  promiennikiem 

podczerwieni. 

3.  Płytkę  umieszczamy  w  komorze  zawierającej  odpowiedni  układ  rozpuszczalników  i  po 

wypoziomowaniu 

komory 

przesuwamy 

w 

kierunku 

pokrywy 

zbiornika 

eluentu 

(doprowadzenie  do  kontaktu  warstwy  adsorbentu  z  rozpuszczalnikiem).  Komorę 

przykrywamy.  

4.  Rozwinięty  chromatogram  suszymy  pod  wyciągiem,  zanurzamy  na  kilka  sekund  w  0,1% 

roztworze  ninhydryny  w  acetonie  i  ponownie  suszymy.  Pojawiają  się  różowofioletowe  lub 

żółte plamki rozdzielanych składników. 

5.  Mierzymy współczynniki R

F

 i identyfikujemy aminokwasy. 

Mieszaninę  aminokwasów  i  aminokwasy  wzorcowe,  układ  rozpuszczalników  oraz  czas 

rozwijania chromatogramu podaje prowadzący ćwiczenia.