1

Mikrobiologia Ćw. 1

Przepisy BHP. Zasady i przesyłania prób do badań bakteriologicznych. Metody sterylizacji.

Zasady pobierania i przesyłania prób:

- w terenie lekarz pobiera próby i kieruje do ZHU lub prywatnych placówek

- drobnoustroje można najłatwiej sobie wyosobnić z materiału chorobowego w początkowym okresie
choroby,
przeciwciała dopiero 2-3 tygodnie po zachorowaniu

- materiał, jeśli to możliwe, powinien być pobierany od zwierząt nieleczonych środkami
przeciwbakteriologicznymi

- do pobranych prób nie wolno dodawać środków dezynfekcyjnych

- wybór materiału do badań zależy od rodzaju choroby, lokalizacji mian oraz rozmieszczenia zarazka w
organizmie,
np. ronienie u krów – błony płodowe, poroniony płód, krew matki

Zakażenia miejscowe – wysięk przyranny, ropa:

- najczęściej pobierany materiał - krew, wydzieliny/wymazy, wydaliny, ropa, płyny ustrojowe
(punktaty), strupy,
zeskrobiny naskórka, biopsje (przyżyciowo wycinki narządów wewnętrznych) oraz sekcyjne (wycinki
ze wszystkich
zmienionych narządów i tkanek).

- sekcje należy przeprowadzać możliwie najszybciej (inwazja komensalistycznej mikroflory z przewodu
pokarmowego do tkanek)

- w trakcie pobierania prób należy unikać zanieczyszczenia ich postronną florą bakteryjną (sterylne
pobranie i
umieszczanie próbki w jałowym naczyniu)

- powstrzymanie procesu gnilnego próbki – niska temperatura i szybki transport próbki do laboratorium
(do 48 h)

- zapobieganie wysychaniu próbki – nawilżanie jałowym płynem fizjologicznym

- zabezpieczenie, czytelne oznakowanie z dołączonym pismem przewodnim (dane o właścicielu, liczbie i
rodzaju
prób, dacie ich pobrania, opis zwierzęcia – gatunek, płeć, wiek, nr ewidencyjny, stwierdzone objawy
chorobowe,
stosowane leczenie, rozpoznanie kliniczne, informacje co do ukierunkowania badania, adres placówki i
nazwisko
lekarza wysyłającego próby).

Metody sterylizacji:

1. Sterylizacja (wyjałowienie) – niszczenie wszystkich form drobnoustrojów (również

przetrwalniki bakterii) w środowisku

2

2. Dezynfekcja (odkażanie) – niszczenie drobnoustrojów chorobotwórczych w środowisku

(większość form wegetatywnych)

3. Pasteryzacja – klasyczna metoda: ogrzewanie produktu do temperatury powyżej 60°C jednak

nie większej niż 100°C (np. typowy proces pasteryzacji mleka polega na ogrzaniu go do
temperatury 100°C w ciągu 1 min. lub do 85°C w ciągu 30 min w zamkniętym urządzeniu
nazywanym pasteryzatorem)

4. UHT (Ultra High Temperature Processing) – polega na błyskawicznym 1-2 sekundowym

podgrzewaniu do temperatury ponad 100°C (135-150°C dla mleka) i równie błyskawicznym
ochłodzeniu do temperatury ponad pokojowej. Cały proces trwa 4-5 sekund. Taka sterylizacja
zabija florę bakteryjną nie zmieniając walorów smakowych produktu.

Liofilizacja:

Suszenie sublimacyjne stosowane do produktów termolabilnych (nieodpornych na ogrzewanie), np.
preparatów farmaceutycznych, cennych składników żywności (owoców, warzyw):

- zamrażanie produktu lub preparatu (np. szczepionki, leki) – mrożenie poniżej -40°C – giną czynniki
powodujące
fermentowanie naturalne produktu, bakterie chorobotwórcze, pleśnie.

- wytworzenie próżni (0,001hPa) niezbędnej do zapoczątkowania sublimacji wody

- usunięcie powstającej pary wodnej

Sterylizacja fizyczna:

1. Termiczna
2. Przy użyciu promieniowania
3. Przy użyciu ultradźwięków

Sterylizacja mechaniczna

1. Przez sączki

Sterylizacja chemiczna.

Ad. Sterylizacja termiczna:

- w płomieniu – ezy, skalpele, pęsety, nożyczki

- w suchym gorącym powietrzu – suszarki (szkło laboratoryjne 2h w 160°C lub 1h w 180°C – powyżej
następuje
zwęglenie papieru i waty, ciemnienie szkła; luźne ułożenie szkła celem ułatwionego obiegu gorącego
powietrza)

- gotowanie – strzykawki, igły, drobny sprzęt, temperatura 100°C niszczy formy wegetatywne
drobnoustrojów, nie
zabija przetrwalników

- w parze bieżącej –aparat Kocha - 100°C przez 1h, nie giną przetrwalniki – unieszkodliwiamy je
metodą
TYNDALIZACJI – frakcjonowanej sterylizacji – trzykrotne wyjaławianie w odstępie 24h, w przerwach
materiał
przechowuje się w temperaturze pokojowej, celem przejścia form przetrwalnikowych w wegetatywne
(wrażliwe),
tyndalizacja stosowana jest do wyjaławiania pożywek wrażliwych na wyższe temperatury.

3

- w parze wodnej nasyconej pod ciśnieniem – autoklawy (para wodna nasycona, pozbawiona
domieszek powietrza),
pod ciśnieniem – podgrzewana uzyskuje wyższą temperaturę niż 100°C, tym wyższą im wyższe
ciśnienie, giną formy
wegetatywne i przetrwalnikowe bakterii, czas sterylizacji 20-30 min. przy 1-1,5 atm.; wyjaławiamy
pożywki, sprzęt
szklany z gumowymi elementami, bielizną, materiał zakaźny.

Ad. Sterylizacja przy użyciu promieniowania:

- promieniowanie UV – źródłem są lampy rtęciowo-kwarcowe, mała przenikliwość, do sterylizacji
pracowni
mikrobiologicznych, sal operacyjnych wraz ze sprzętem znajdującym się w nich, sterylizacja zwykle 2-
3h.

- promieniowanie Gamma – duża przenikliwość i skuteczność bakteriobójcza, sterylizacja dużych ilości
materiałów,
ostateczne; sterylizacji gotowych i opakowanych produktów (strzykawki, igły), produktów wrażliwych
na
ogrzewanie naczyń z tworzyw sztucznych.

Ad. Sterylizacja przy użyciu ultradźwięków:

- rozbijają komórki (20-100 kHz) – do mycia delikatnych narzędzi.

Ad. Sterylizacja mechaniczna:

Wyjaławianie za pomocą sączenia przez sączki (filtry bakteryjne działają na zasadzie sita
zatrzymującego obiekty większe niż pory sączka; sącząc można stosować ciśnienie ujemne,
wytworzone przez pompę próżniową lub dodatnie przez wtłaczanie powietrza; wyjaławianie surowicy,
roztwory enzymów, płyny wrażliwe na wyższe temperatury)

- filtry porcelanowe Chamberlanda (glazurowana porcelana) i Barkefelda (z ziemią okrzemkową)

- filtry Seitza (celulozowo-azbestowe)

- filtry Schotta (szklane)

- filtry membranowe (celulozowe)

- filtry gradokolowe (koloidum rozpuszczone w kwasie octowym)

Ad. Sterylizacja chemiczna:

Wyjaławianie specjalnego sprzętu i aparatów, np. sztuczna nerka (skomplikowana budowa i obecność
plastikowych i gumowych części).

Jako środka wyjaławiającego stosuje się tlenek etylenu, kwas nadoctowy, formaldehyd i inne.

4

Mikrobiologia Ćw. 2

Sporządzanie preparatów:

1. Czyste szkiełko podstawowe odtłuszczamy (otarcie jego powierzchni mydłem i dokładne

wyczyszczenie czystą szmatką).

2. Jałowo pobranym wycinkiem narządu dotykamy powierzchnię szkiełka, przy wymazach dotyka

się szkiełko wacikiem, materiał płynny nanosi się ezą lub pipetą Pasteura, z krwi sporządza się
rozmaz, przy sporządzeniu preparatu bakterii z podłoża stałego nanosi się drobną ilość kolonii
bakteryjnej i miesza z kroplą płynu fizjologicznego.

3. Preparat suszymy w temperaturze pokojowej (do zmatowienia wyglądu).
4. Utrwalenie preparatu przez kilkakrotne przeciągnięcie przez płomień palnika lub przy użyciu

utrwalaczy chemicznych.

5. Barwienie.

Tok postępowania rozpoznawczego. Mikroskopia:

Sporządzanie, barwienie i obserwacja preparatów mikroskopowych. Barwienie metodą Loefflera.

Nadesłany materiał badawczy

Wycinek narządu

Badanie mikroskopowe

Izolacja

Identyfikacja:
- biochemiczna
- serologiczna
- lizotypia

Surowica

Antybiogram

Badanie serologiczne

Próba biologiczna

Badanie mikroskopowe – morfologiczne:

Sporządzanie, zabarwianie i obserwacja mikroskopowa preparatu w celu zorientowania się co do składu
flory bakteryjnej próby (jednorodna lub mieszana).

Tylko na podstawie obrazu mikroskopowego, przy odpowiednim barwieniu, można określić z dużym
prawdopodobieństwem przynależność taksonomiczną:

- pałeczka ronienia zakaźnego (Brucella abortus) – barwią się zmodyfikowaną metodą Ziehl-Neelsena,
wykazują względną kwasooporność, czerwone bakterie.

5

- pałeczka posocznicy krwotocznej (Pasteurella) – otoczkowa forma, barwi się dwubiegunowo metodą
Loefflera, charakterystyczna agrafka

- laseczka wąglika (Bacillus anthracis) – laseczki układają się jedna za drugą, w krótkie łańcuszki
otoczone otoczką, przypominają kij bambusa.

Izolacja – badanie hodowlane:

Wyosobnienie zarazka w postaci pojedynczej kolonii, z badanego materiału, przez odpowiedni posiew
badanej próby na podłoże stałe i jego inkubację (posiew sektorowy, izolacyjny – rozrzedzenie
materiału na różnych sektorach).

Obecność kolonii o różnej morfologii wskazuje na mieszane zakażenie próby.

Dane uzyskane w trakcie izolacji ukierunkowują dalsze postępowanie rozpoznawcze.

W trakcie badań hodowlanych stosujemy podłoża wybiórcze, które uniemożliwiają wzrost saprofitów
(postronnej flory bakteryjnej), a pozwalają wzrastać bakteriom poszukiwanym.

Większą ilość poszukiwanego zarazka uzyskujemy posiewając wyizolowane kolonie na podłoże płynne.

Posiew sektorowy (izolacyjny, redukcyjny).

Identyfikacja biochemiczna:

„Garnitur enzymatyczny” – pula enzymów charakterystyczna dla danej bakterii.

Posiew wyosobnionego zarazka na tzw. „rząd biochemiczny” (różne podłoża różnicujące, z których
każde pozwala na wykazanie pojedynczej, określonej cechy biochemicznej lub jej wykluczenie u
badanej bakterii).

Wyniki porównuje się z odpowiednimi zestawieniami tych właściwości poszczególnych gatunków, co
umożliwia identyfikację zarazka.

Identyfikacja serologiczna:

Podstawą jest swoista reakcja nieznanego antygenu (zarazka) ze znanym przeciwciałem (surowica
diagnostyczna).

Swoista reakcja – z danym antygenem reaguje tylko to przeciwciało, które powstało pod jego
wpływem.

Badanie to przeprowadzamy za pomocą odczynów: aglutynacji, precypitacji, wiązania dopełniacza,
immunofluorescencji itp.

Obecność postronnej flory bakteryjnej nie wpływa na wynik odczynu!!!

Lizotypia – identyfikacja za pomocą bakteriofagów.

Typowanie wyosobnionych zarazków przy użyciu bakteriofagów (wirusów bakterii powodujących ich
rozpuszczenie – lizę), pozwalające zróżnicować szczepy w obrębie gatunku – TYPY FAGOWE.

Ze względu na wysoką czułość lizotypia znalazła zastosowanie w szczegółowych dochodzeniach
epidemiologicznych.

Antybiogram – badanie wrażliwości na chemioterapeutyki:

określanie wrażliwości lub oporności bakterii na poszczególne chemioterapeutyki (leki o działaniu
przeciwbakteryjnym).

6

Pozwala lekarzowi w terenie na zastosowanie najskuteczniejszego środka (najmniejsza dawka –
najlepszy efekt). W leczeniu schorzenia wywołanego wyosobnionym zarazkiem.

Badanie biologiczne na zwierzętach:

Przeprowadzamy w celu izolacji zarazka, stwierdzenia jego chorobotwórczości, zjadliwości itp.

Odpowiednio przygotowany materiał lub zawiesinę badanych bakterii wprowadzamy zwierzętom
doświadczalnym (myszkom, świnkom morskim, królikom itd.) i obserwuje się je klinicznie,
anatomopatologicznie itp.

Badanie serologiczne:

Poszukiwanie w surowicy (serum) za pomocą znanego antygenu diagnostycznego (zarazka) swoistych
dla niego przeciwciał.

Może stanowić uzupełnienie toku postępowania rozpoznawczego (jeśli do badania przesłano także
surowicę) lub jest odrębnym postępowaniem rozpoznawczym – serodiagnostycznym.

Serodiagnostyka jest jedynym sposobem rozpoznawania zakażenia w bezobjawowych infekcjach o
długim okresie inkubacji, przebiegających z długim okresem utajenia oraz masowych przeglądach
epizootiologicznych.

Dodatni wynik badania serologicznego nie rozstrzyga, czy obecność przeciwciał jest efektem
szczepienia, czy przebytego dawniej zakażenia, czy też trwającego obecnie procesu chorobowego.
Dlatego wykonujemy tzw. „badanie par surowic” (surowica pobrana od tego samego osobnika w
początkowym okresie choroby i w późniejszym okresie, po 2 tygodniach – wzrost miana przeciwciał w
surowicy pobranej w drugiej fazie choroby, wskazuje na toczący się aktualnie proces chorobowy).

Do barwników dodaje się często bezbarwnych związków tzw. bejce lub zaprawy (fenol w fuksynie
karbolowej lub ług sodowy w błękicie Loefflera), które ułatwiają wnikanie barwnika do wnętrza komórki
oraz ułatwiają połączenie barwnika z jej elementami (płyn Lugola w metodzie Grama).

Metody barwienia:

- barwienie proste, monochromatyczne, jednobarwne – przy użyciu jednego barwnika, np. Loefflera

- barwienie złożone, polichromatyczne, wielobarwne – zastosowanie kilku barwników, np. Grama,
Ziehl- Neelsena

Barwienia preparatów:

- barwienie pozytywne – barwienie samych drobnoustrojów

- barwienie negatywne – barwienie tła, bakterie niezabarwione

- barwienie kombinowane – równoczesne barwienie tła i komórek bakteryjnych.

Drobnoustroje można barwić przyżyciowo albo po zabiciu (utrwalanie).

Do barwienia używa się najczęściej zasadowych barwników anilinowych (błękit metylenowy, safranina,
zieleń malachitowa, fiolet goryczki, hematoksylina), niekiedy kwaśnych (kwaśna fuksyna, eozyny).

Barwniki trudno rozpuszczają się w wodzie, a ich roztwory wodne łatwo się odbarwiają i mętnieją.
Dlatego najpierw przygotowuje się trwałe roztwory alkoholowe barwników (roztwory macierzyste) i
dopiero potem rozcieńcza się je wodą , sporządzając roztwory użytkowe (bakterie nie barwią się
roztworami alkoholowymi).

7

Barwienie proste metodą Loefflera:

- utrwalony nad płomieniem preparat pokrywamy roztworem błękitu metylenowego Loefflera na 5 min.

- zlewamy barwnik

- preparat spłukujemy wodą i suszymy bibułą

Preparat oglądamy pod mikroskopem w 100x powiększeniu pod imersją. Bakterie barwią się na kolor
niebieski.

Mikrobiologia Ćw. 3

Mikroskopia – sporządzanie, barwienie i obserwacja preparatów mikroskopowych.

Barwienie metodami: Grama, Burri-Ginsa, Schaeffer-Fultona, Ziehl-Neelsena.

Barwienie złożone metodą Grama:

- zabarwienie preparatu fioletem krystalicznym lub goryczkowym (Gencjana)

- utrwalenie połączenia barwnik-komórka płynem Lugola (bejca)

- odbarwianie preparatu alkoholem

- dobarwianie fuksyną

Bakterie, które mimo odbarwienia zatrzymały barwnik podstawowy (fiolet) nazwano Gram dodatnimi
(G+), które odbarwiły się i przyjęły barwnik kontrastowy (fuksynę – czerwone lub inne) Gram
ujemnymi (G-).

Z czym związane są różnice barwliwości drobnoustrojów w metodzie Grama?

- obecność białka zasadowego i rybonukleinianu magnezu w błonie cytoplazmatycznej bakterii G+

- różnice punktów izoelektrycznych bakterii G+ i G-

- różnice w budowie i składzie chemicznym ściany komórkowej

Ściana bakterii G+:

Ściana bakterii G-:

- gruby peptydoglikan

- kwasy teichowe

- w komórkach kwasoopornych
obecność kwasu mykolowego

- nie wyróżnia się zewnętrznej
błony
komórkowej

- cienki peptydoglikan

- brak kwasów teichowych

- błona zewnętrzna

Grama +:

Grama - :

- ziarniaki (nieomal wszystkie)

- ziarniaki rodzaju Neisseria

8

- laseczki przetrwalnikujące

- maczugowce

- prątki

- pałeczki

- przecinkowce

- krętki

Barwienie struktur bakteryjnych:

- otoczki – polipeptydowe lub wielocukrowe warstwy otaczające ścianę komórkową niektórych
mikroorganizmów

- przetrwalniki – endospory umożliwiające danemu gatunkowi przetrwanie w niesprzyjających
warunkach

- rzęski – długie, cienkie wypustki – narząd ruchu bakterii

Barwienie otoczek metodą Burri-Ginsa:

- na szkiełko podstawowe nanosimy zawiesinę hodowli drobnoustrojów i mieszamy z tuszem
kreślarskim za pomocą
drugiego szkiełka – sporządzamy rozmaz

- po wysuszeniu preparat utrwalamy nad płomieniem, barwimy fuksyną fenolową przez 1-2 min.

- preparat spłukujemy wodą i suszymy bibułą

- obecność otoczek ujawnia się jako jasna, niezabarwiona na ciemnym tle obwódka, otaczająca
zabarwione na
czerwono bakterie.

Barwienie przetrwalników metodą Schaeffer-Fultona:

- na utrwalony w płomieniu preparat nanosimy 5% roztwór zieleni malachitowej i podgrzewamy
trzykrotnie w ciągu
60 s do ukazania się pary (nie dopuszczamy do zagotowania się barwnika – wyschnie)

- po ostygnięciu preparat spłukujemy wodą i dobarwiamy 0,5% roztworem safraniny przez 30 s

- ponownie preparat spłukujemy wodą i suszymy bibułą

- w obrazie mikroskopowym stwierdzamy zabarwione na zielono przetrwalniki i na czerwono komórki
bakteryjne

Barwienie bakterii kwasoopornych metodą Ziehl-Neelsena:

- na utrwalony w płomieniu preparat nanosimy roztwór fuksyny karbolowej i podgrzewamy trzykrotnie
w ciągu 60 s
do ukazania się pary (nie dopuszczamy do zagotowania się barwnika – wyschnie)

- preparat spłukujemy wodą i pokrywamy do 0,5% kwasem octowym na 30 s (nie dłużej!!!)

- ponownie dokładnie spłukujemy wodą

9

- dobarwiamy preparat 1% błękitem metylenowym Loefflera przez 20-30 s

- po spłukaniu barwnika wodą preparat suszymy bibułą

- w obrazie mikroskopowym stwierdzamy zabarwione na czerwono komórki bakterii kwasoopornych i
na niebiesko
pozostałe bakterie

Barwienie bakterii metodą Grama w modyfikacji Kopeloffa i Beermana:

- preparat suszymy na powietrzu i nie utrwalamy !!!

- pokrywamy preparat roztworem A i dodajemy 2-3 krople roztworu B, mieszamy przez przechylanie i
barwimy przez
2-3 min.

- spłukujemy płynem Lugola

- pokrywamy świeżym płynem Lugola na 2-3 min.

- spłukujemy wodą preparat

- odbarwiamy mieszaniną acetonu i eteru lub acetonu i chloroformu (1:1), dodając po kropli, aż do
usunięcia
barwnika

- dobarwiamy barwnikiem kontrastowym, np. fuksyną przez 5-10 s

- spłukujemy wodą preparat i suszymy bibułą

- w obrazie mikroskopowym stwierdzamy zabarwione na czerwono komórki bakterii G- i na fioletowo
komórki
bakterii G+

Mikrobiologia Ćw. 4

Badanie hodowlane

Pożywki bakteryjne. Sposoby posiewów bakterii. Metody hodowli bakterii tlenowych i

beztlenowych. Morfologia hodowli płynnej i kolonii bakteryjnej.

Tok postępowania rozpoznawczego (wcześniejszy wykres)

Pożywki bakteryjne:

Pożywka – odpowiednio dobrane podłoże służące do hodowli mikroorganizmów w warunkach
laboratoryjnych.

Cechy podłoża bakteriologicznego:

- zawiera odpowiednie składniki odżywcze

10

- odpowiednie pH

- izotoniczne

- przejrzyste (z pewnymi wyjątkami)

- jałowe

Podział podłóż:

- płynne – wyciąg mięsny, bulion, woda peptonowa

- półpłynne – 0,25-0,5% agaru

- stałe – agar odżywczy (2-3% agaru), podłoże żelatynowe, podłoża z ziemniaka

Podłoża płynne:

- wyciąg mięsny – podstawowy składnik podłoży, sporządza się go z mielonego mięsa wołowego lub
końskiego
(oczyszczone z tłuszczu i błon), zalanego podwójną ilością wody i pozostawionego na około dobę w
szafie
chłodniczej.

Po przegotowaniu i przesączeniu wyciąg dopełnia się wodą do objętości wyjściowej i sterylizuje w
autoklawie.

- bulion – wyciąg mięsny z dodatkiem 1-2% peptonu i 0,5% NaCl. Pepton – produkt częściowego
enzymatycznego
trawienia białka (mieszanina wolnych aminokwasów i polipeptydów). Źródło azotu dla bakterii,
niezdolnych do
rozkładania białka nienadtrawionego. NaCl zapewnia odpowiednie ciśnienie osmotyczne (izotonię).
Wymagane pH
(7,2-7,4) uzyskuje się przez stopniowe dodawanie 10% roztworu NaOH lub HCl (kontrola
pehamterem)

- woda peptonowa – woda destylowana, pepton, NaCl

Podłoża stałe:

- podłoże agarowe – składa się z bulionu i agaru w ilości około 2-3%. Agar otrzymywany jest z
wodorostów morskich
(Agar Agar). W wodzie w temperaturze 100°C przechodzi w stan płynny, po oziębieniu poniżej 45°C
zestala się
tworząc elastyczną masę, dającą się ponownie upłynnić po podgrzaniu do 100°C. Podłoże agarowe w
temperaturze
inkubacji (37°C – optymalna dla większości bakterii chorobotwórczych) zachowuje stałą konsystencję.
Agar nie jest
składnikiem odżywczym dla bakterii – służy do zestalenia pożywek.

- podłoże żelatynowe – składa się z bulionu i 15-20% dodatku żelatyny. W temperaturze 30-35°C
przechodzi w stan
płynny. Nie nadaje się jako pożywka w hodowli inkubowanej w 37°C. w odróżnieniu od agaru,

11

żelatyna stanowi
pożywkę dla drobnoustrojów.

Obecnie w handlu znajdują się gotowe preparaty suchych podłóż – buliony, agaru odżywczego, podłoża
McConkeya, Klinglera i innych.

Podział podłóż ze względu na skład:

- naturalne – sporządzone z wyciągów z tkanek roślinnych lub zwierzęcych (niekiedy z dodatkiem krwi,
surowicy lub
innych płynów ustrojowych)

- syntetyczne – zawierają wodę, sole mineralne i składniki odżywcze (aminokwasy, witaminy i inne
substancje
chemiczne)

- zwykłe (ubogie) – bulion zwykły, agar zwykły

- wzbogacone (specjalne) – podłoża zwykłe z dodatkiem np. składników odżywczych (glukozy, wyciągu
drożdżowego,
krwi, surowicy, żółtka jaja itp.) lub czynników wzrostowych (witamina K, niektórych aminokwasów,
PABA, heminy,
koenzymów I i II).

Podział podłóż ze względu na przeznaczenie:

- wybiórcze – umożliwia rozwój danego gatunku bakterii chorobotwórczych, a hamuje wzrost
pozostałej flory
bakteryjnej. Do izolacji określonych gatunków drobnoustrojów z materiału zanieczyszczonego
postronną florą
bakteryjną

- różnicujące – daje możliwość wykrycia właściwości biochemicznych i fizjologicznych hodowanych
drobnoustrojów

Podział podłóż ze względu na zastosowanie:

- transportowe – półpłynne, tylko do przechowania bakterii w czasie transportu

- transportowo-wzrostowe – do posiewu krwi (hemomedium, anaeromedium) – wstrzykiwanie próby na
podłoże;
płynu mózgowo-rdzeniowego (meningomedium); moczu (dip-slide: uromedium, uricult) – znaczenie
podłoża w
próbce

- wzrostowe

Cel posiewów na podłożach bakteriologicznych:

- izolacja zarazka – uzyskanie czystej hodowli

12

- sporządzanie szczepionki lub antygenu diagnostycznego – namnożenie określonego gatunku
mikroorganizmów lub
produktów jego przemiany materii

- identyfikacja zarazka metodą biochemiczną

* posiewy wykonujemy za pomocą: wyjałowionej ezy bakteriologicznej, szklanej bagietki, pipety
Pasteura lub
zwykłej.

- podłoże umieszcza się najczęściej na płytkach Petriego lub w probówkach (postać słupka – agar
słupkowy, postać
skosu – agar skośny)

- płytki przechowywane w lodówce, przed posiewem podsuszamy (20 min.), układając je otwarte i
odwrócone w
cieplarce

- naczynie z podłożem przed posiewem czytelnie oznaczamy (numer próby, data – probówki na 1/3
wysokości od
góry, płytki na denku, nie na wieczku!!!)

- w trakcie posiewów należy unikać zanieczyszczenia podłoża postronną mikroflorą (podłoża otwieramy
tylko na czas
niezbędny, trzymamy ukośnie, wylot naczyń – probówek opalamy w płomieniu przed i po
manipulacjach)

- korki chwytamy piątym palcem ręki za część wystającą z probówki

Izolacja czystych hodowli:

- w pracy bakteriologicznej dąży się zawsze do uzyskania czystych hodowli danego gatunku bakterii i
jego
pojedynczych kolonii (pozwala poznać ich morfologię i różnicować)

- najczęściej w laboratoriach stosowana jest metoda posiewu sektorowego – posiew badanego
materiału na kilku
polach (sektorach) powierzchni stałego podłoża

- na pierwszym polu posiewu wzrost drobnoustrojów jest najobfitszy, na drugim rzadszy, a na trzecim i
czwartym
wyrastają z reguły już pojedyncze kolonie zarazka

- posiane podłoża inkubuje się przez określony czas w cieplarkach, zwykle w temperaturze 37°C i w
atmosferze
zapewniającej wzrost danym zarazkom

- bakterie beztlenowe namnażają się tylko w atmosferze pozbawionej tlenu i wymagają specjalnych
metod hodowli

Metody hodowli bakterii beztlenowych:

1. Metody fizyczne:

13

– hodowla w anaerostatach – posiane podłoża umieszczamy w szczelnie zamkniętych
naczyniach, powietrze usuwamy za pomocą pompy próżniowej (hodowla w próżni) lub
zastępujemy je gazem obojętnym dla bakterii, np. azotem, wodorem, dwutlenkiem węgla. Płytki
agarowe inkubowane w próżni ustawia się wieczkiem do góry, zapobiegając odklejaniu się
podłoża od szkła).

- podłoże Wrzoska – bulion zawierający kawałki jałowej wątroby (w podłoży Robertsona –
kawałki serca), pokryte warstwą parafiny. Wycinki wątroby (serca) obniżamy potencjał
oksydoredukcyjny bulionu, parafina uniemożliwia dostęp powietrza do pożywki po sterylizacji. W
przypadku użycia bulionu, wcześniej przygotowanego, poddaje się zabiegowi regeneracji –
gotowanie celem usunięcia resztek powietrza

- wysoki słupek agarowy – posianie badanej próby na upłynniony i ostudzony do temperatury
48°C wysoki słupek agarowy (8-10 cm). Po zestaleniu się podłoża powstają w nim warunki
beztlenowe.

2. Metody chemiczne:

- umieszczeniu w hermetycznie zamkniętym naczyniu substancji chemicznych np.: pirogallolu w
środowisku
alkalicznym – wiąże tlen; wprowadzenie do pożywki związków redukujących np.: tioglikanu
sodowego, cysteiny –
obniżających potencjał oksydoredukcyjny

3. Metoda biologiczna:

- płytka Fortnera – hodowla w jednym szczelnie zamkniętym naczyniu beztlenowców i bakterii
tlenowych. Po zużyciu
tlenu przez tlenowce powstają warunki sprzyjające rozwojowi beztlenowców.

4. Metoda kombinowana:

- fizykochemiczna – eksykator uszczelniony wazeliną, naczynie z pirogalolem i KOH, dodatkowo świeca
do szybkiego
zużycia tlenu

Wzrost bakterii na podłożach:

- bakterie wprowadzone do pożywki rosną i namnażają się przez podział i po odpowiednim czasie
tworzą populację
bakteryjną – hodowlę

- hodowla mieszana – w pożywce lub na niej namnożyły się różne gatunki bakterii

- hodowla czysta – w pożywce lub na niej namnożyły się drobnoustroje należące tylko do jednego
gatunku

- hodowla płynna – hodowla bakterii w pożywce płynnej

- kolonia bakteryjna – lokalne, ograniczone, widoczne gołym okiem, na podłożu stałym, nagromadzenie
komórek
potomnych, wywodzących się od jednej bakterii.

14

Mikrobiologia Ćw. 5

Wzrost i charakterystyka drobnoustrojów na podłożach stałych

Zastosowanie:

- w diagnostyce; przy otrzymywaniu czystych kultur oraz w analizach ilościowych

Charakterystyka wzrostu kolonii bakteryjnej na płytce Petriego:

Obserwacja kolonii:

Przeprowadza się przy pomocy lupy, binokularu, biorąc pod uwagę:

- wielkość (średnica w milimetrach) oraz kształt kolonii np. okrągły, nieregularny, rozgałęziony,
nitkowaty. Niektóre
bakterie mogą nie tworzyć pojedynczych kolonii, lecz zarastać całe podłoże dając wzrost rozlany
(Proteus), inne
tworzą kolonie rozpełzające się po powierzchni podłoża (Bacillus).

- brzeg kolonii: gładki, falisty, regularny lub nieregularny, płatowaty regularny lub nieregularny,
ząbkowany regularny
lub nieregularny, nitkowaty

- powierzchnia kolonii: gładka, pomarszczona, lśniąca, matowa

- barwa kolonii i jej przejrzystość: zabarwione, niezabarwione, przezroczyste, mętne, opalizująca,
nieprzezroczysta.

- konsystencja (struktura): zwarta, luźna, drobnoziarnista, gruboziarnista.

- profil kolonii ponad powierzchnią pożywki: płaski, wyniosły, soczewkowaty niski, soczewkowaty
wysoki, pępkowaty

Cechy diagnostyczne wzrostu mikroorganizmów na różnych podłożach:

Płytka Petriego

Wymiary kolonii, kształt kolonii, brzeg kolonii, powierzchnia kolonii, konsystencja, barwa kolonii lub
podłoża, wyniosłość – profil

Typy (fazy) kolonii powierzchniowych:

- „S” (smooth – gładki) – brzeg kolonii gładki, powierzchnia wypukła, bez wzniesień i wgłębień (kolonie
młode i
zjadliwe formy bakterii chorobotwórczych)

- „R” (rought – szorstki) – brzeg kolonii nierówny, płatowaty lub nitkowaty i szorstka powierzchnia.
Kolonie takie
tworzą niezjadliwe formy bakterii (te same bakterie wytwarzają kolonie gładkie – są chorobotwórcze)

- „G” (gonidial – gonidialny) – kolonie bardzo drobne o średnicy 1 mm, tworzone bez drobne bakterie

- „M” (mucoid- śluzowaty) – kolonie gładkie o powierzchni śluzowatej, błyszczącej, wytwarzane przez
bakterie ze
śluzową otoczką

- „L” (L-formy) – powstałe spontanicznie lub w niesprzyjających warunkach środowiska. Kolonia taka
składa się z
komórek bardzo drobnych – przesączalnych, poprzez formy ziarniste i pałeczkowate do form

15

olbrzymich o średnicy
dochodzącej do 10 um.

Wzrost i charakterystyka hodowli na skosie agarowym:

Przy posiewie na skosie bakterie najczęściej nie tworzą wyodrębnionych kolonii (sposób wzrostu jest
również ważną cechą diagnostyczną)

Wzrost bakterii na skosie opisujemy uwzględniając następujące cechy:

- charakter wzrostu: jednolity (w postaci zwartego nalotu komórek), perlisty (tworzą się oddzielne
niezlewające się
ze sobą kolonie), o brzegach gładkich, ząbkowanych, kolczastych, ziarnistych, krzewiastych,
nieregularny itp.

- powierzchnia rysy: lśniąca, matowa, czasem cienka sucha błonka

- struktura: gładka, ziarnista, pofałdowana

- barwa i przezroczystość

Typy wzrostu bakterii w hodowlach rysowych: drzewiasty, mgławicowy, pierzasty, korzonkowy,
perlisty, jednolity

Cechy diagnostyczne wzrostu mikroorganizmów na różnych podłożach:

Skośny agar: intensywność wzrostu, charakterystyka brzegu linii wzrostu, konsystencja, barwa

Wzrost drobnoustrojów na słupku w hodowli kłutej opisujemy uwzględniając następujące
cechy:

- ruchliwość

- upłynnienie żelatyny (w przypadku bakterii proteolitycznych), a także charakter upłynnienia wzdłuż
nakłucia

- zależność bakterii od zapotrzebowania na tlen

Określenie stosunku bakterii do wolnego tlenu (badanie wzrostu na słupku agarowym
bakterii wprowadzonych igłą do dna probówki):

- bezwzględne tlenowce rosną tylko na powierzchni pożywki

- bezwzględne beztlenowce rosną tylko w dolnych partiach pożywki

- względne beztlenowce rosną na całej wysokości słupka

- mikroaerofile rosną tuż pod powierzchnią pożywki

Wzrost bakterii na żelatynie kłutej:

Brak upłynnienia, upłynnienie kraterowate ??????????????????????

Słupek żelatynowy: wzrost powierzchniowy, wzrost wzdłuż linii kłucia, wzrost w dolnej części słupka i
upłynnienie żelatyny

16

Identyfikacja bakterii metodami biochemicznymi:

Badanie właściwości ( metody klasyczne, metody współczesne – system API, Enterotube, komputerowe
systemy identyfikacji)

Biochemiczne różnicowanie bakterii:

Materiał z pojedynczej wyizolowanej kolonii posiewamy na szereg podłóż (różnicujące, wybiórcze
różnicujące) o znanym składzie – rząd biochemiczny

Po odpowiednim okresie inkubacji w cieplarkach określamy zmiany jakim ulegają podłoża

Uzyskane wyniki porównuje się z odpowiednimi zestawieniami właściwości biochemicznych
poszczególnych drobnoustrojów, co pozwala na identyfikację badanego zarazka

Zmiany podłóż w trakcie identyfikacji biochemicznej:

- zmiana barwy

Zmiana pH i zmiana barwy podłoża na skutek obecności wskaźników (indykatorów)

Reakcje związków wytwarzanych na podłożu ze związkami dodanymi do pożywki

- zmiana konsystencji

 Ścięcie

 Upłynnienie

- wydzielanie gazu

 Pienienie

 Rozrywanie słupka

Związaniu gazu ze związkami dodanymi do podłoża i zmiana jego barwy

-

- Chapmana lub mannitol salts agar (MSA) ( zawiera duże stężenie soli i mannitol) – szczepy
chorobotwórcze
powodują zażółcenie podłoża

-agar McConkey

Salmonella (kolonie bezbarwne) – bakterie ujemne

E. coli (kolonie różowe) – laktozododatnie

Bakterie grupy E. coli rosną na pożywce ENDO w postaci ciemnoczerwonych kolonii o metalicznym
połysku

Podłoże Cevina

Zebowitza lub TG, obecnie Baird-Parkera (zawiera teluryn potasu i glicynę) – gronkowce
koagulazododtanie (patogenne) – rosną w postaci czarnych kolonii i koagulazoujemnych – wzrost jest
albo zahamowany albo powstają jedynie nieliczne, szare, małe, kolonie

17

- podłoże silnie wybiórczo-różnicujące – SS (Salmonella- Shigella) Salmonella – kolonie żółte z
czarnym środkiem,
Shigella – różowe kolonie, Proteus – żółty z zaczerwienieniem

Podłoże Wilson –Blaira - z podłoża Wrzoska posiewamy pare kropli na płytkę Petriego i zalewamy
roztopionym podłożem Wilson-Blaira. Po zastygnięciu podłoża zalewamy dodatkową warstwą agaru
zwykłego w celu stworzenia warunków beztlenowych. Wzrost przetrwalnikujących beztlenowców
wyraża się zaczernieniem podłoża w miejscu wzrostu kolonii (beztlenowce wytwarzają siarkowodór,
który łączy się z chlorkiem żelaza, będącym w podłożu i wytrąca się siarczan-żelaza).

Mikrobiologia Ćw. 6

Metody identyfikacji biochemicznej

Metody klasyczne:

- pośrednie

- bezpośrednie

Metody współczesne:

- Systemy API

- metoda Enterotube

- komputerowe systemu identyfikacji bakterii i automatyzacji

Pośrednie:

Rozkład cukrów:

- wykrywanie różnic w zdolności do rozkładu różnych cukrów (glukoza, laktoza, sacharoza, mannitol,
fruktoza, itp.)

- nieposiane podłoża mają barwę jasnosłomkową, filetową lub czerwoną (w zależności od rodzaju
danego wskaźnika)

- rozkład cukrów prowadzi do fermentacji (octowa, alkoholowa, masłowa, itp.), podczas której pH
spada < _lub
równo) 7 – zakwaszenie środowiska, pod wpływem indykatora powoduje to zmianę barwy podłoża
(zwykle na kolor
czerwony lub żółty) oraz bez lub z wytworzeniem gazu –CO

2

(widoczny w rurce fermentacyjnej

Durhama).

Rozkład związków zawierających azot:

- rozkład białka, AA, związków azotowych (dezaminacja, dekarboksylacja, itp.), alkalizacja środowiska
(pH>7) i zmiana
barwy podłoża (dzięki obecności wskaźnika w podłożu), możliwość uwalniania gazu (siarkowodór,
amoniak)

- zdolność do wytwarzania siarkowodoru – rozkład AA zawierających siarkę, bada się na specjalnych
podłożach
(podłoże Kliglera, SS, itp.)Pod wpływem powstającego siarkowodoru następuje czarnienie podłoża

Podłoże Kliglera lub TSI (Triple Sugar Iron):

18

- stałe podłoże diagnostyczne w probówkach w postaci skosów dla pałeczek Gram – , o małych
wymaganiach
odżywczych (Enterobarcteriaceae)

- pozwala zbadać zdolność rozkładu glukozy, laktozy i wytworzenie siarkowodoru

- posiew zarówno w części słupkowej (wkłucie), jak i skośnej

- podłoże zawiera m.in. mało glukozy i 10-krotnie więcej laktozy ( w proporcji 1:10), tiosiarczan i jony
żelaza, które są
wskaźnikiem wytwarzania H

2

S oraz wskaźnik pH

- ocena podłoża powinna być wykonana po 24 h

- wytwarzanie w czasie fermentacji cukrów, dużych ilości CO

2

lub H

2

uwidacznia się przez rozerwanie

lub unoszenie
podłoża

- rozkład glukozy przejawia się zakwaszeniem i zażółceniem jałowego jasnoczerwonego podłoża.
Zmiana postępuje
szybciej w części skośnej, gdzie wkrótce pojawia się powrót do barwy wyjściowej, z powodu wtórnej
alkalizacji
będącej wynikiem rozkładu aminokwasów (skos jasnoczerwony + słupek żółty = rozkład glukozy)

- jeśli będzie rozkładana laktoza, żółte zabarwienie obu części utrzymuje się przez wiele godzin (skos
żółty + słupek
żółty = rozkład laktozy)

- brak rozkładu cukrów wiąże się z alkalizacją pożywki, która pogłębia swoją wyjściową barwę,
przyjmując kolor
czerwony

- tworzenie się H

2

S z tiosiarczanem zachodzi powoli w kwaśnym środowisku słupka i powoduje

powstawanie
nierozpuszczalnego czarnego strątu siarczanu żelaza

Zdolność produkowania indolu – do podłoża z wodą peptydową i tryptofanem, po odpowiednim czasie
inkubacji, dodaje się do podłoża kilka kropli odczynnika Kovacsa. Obecność indolu widoczna jest w
górnej warstwie w kształcie wiśniowego pierścienia. Jeśli badane bakterie nie wytwarzają tego
produktu pierścień pozostaje barwy odczynnika

Zdolność rozkładu mocznika – wykrywane na podłożu Christensena z mocznikiem. Jeśli posiane
bakterie wytwarzają ureazę i rozkładają mocznik, to rozkładowi towarzyszy produkcja amoniaku, który
alkalizując podłoże zmienia jego kolor z żółtego na czerwono-fioletowy

Zdolność dekarboksylacji lizyny – posiew na podłoże Falkowa, gdzie następuje alkalizacja podłoża i
zmiana barwy z żółtej na fioletową.

Metody bezpośrednie:

Próba na koagulazę – do roztworu plazmy króliczej wprowadzamy na około 18-24h hodowlę badanych
zarazków. Zawartość probówki mieszamy (wstrząsanie) i wstawiamy do cieplarki. W razie wytwarzania
koagulazy przez badany szczep, plazma ulega ścięciu (galaretowaty skrzep).

Orientacyjnie można tę próbę wykonać także na szkiełku podstawowym, dodając do zawiesiny bakterii
małą ilość plazmy. Dodatni wynik – zlepianie bakterii w grudki

19

Próba na katalazę – do bulionowej hodowli bakteryjnej dodać kilka kropli 3% roztworu wody utlenionej.
Przy dodatnim wyniku unosi się duża liczba pęcherzyków gazu, tworząc na powierzchni płyną obfitą
pianę.

Próbę tę można przeprowadzić także na szkiełku podstawowym, na które nanosimy materiał badanej
kolonii lub dużą kroplę hodowli bulionowej i mięsa z kroplą roztworu wody utlenionej.

Możliwe jest także naniesienie bezpośrednio na badaną kolonię 1-2% roztworu wody utlenionej. Wynik
dodatni – powstanie pęcherzyków gazu.

Próba wytworzenie lipazy – stwierdzamy na podłożu z żółtkiem jaja, na które posiewa się bakterie w
sposób umożliwiający uzyskanie pojedynczej kolonii. Drobnoustroje wytwarzające ten enzym powodują
przejaśnienie podłoża wokół kolonii.

Próba wytworzenia hemolizy – posiew bakterii na podłoże agarowe z krwią w celu wykazania zdolności
hemolizy (rozpuszczają krwinki czerwone)

Hemolizę podzielono na typy oznaczone literami alfabetu greckiego, w zależności od różnic działania na
krwinki różnych gatunków zwierząt oraz odmiennego charakteru (strefa hemolizy, ostrość granic i
stopień przejaśnienia)

Hemoliza alfa – wokół kolonii pojawia się strefa zielono-brązowa, na skraju której można zauważyć
zupełną hemolizę objawiającą się zupełnym przejaśnieniem podłoża.

Hemoliza alfa’ – w wąskiej strefie zupełnej hemolizy znajdującej się na obwodzie strefy o barwie
zielonkawo-brązowej, stwierdza się niezhemolizowane krwinki czerwone. Niewyraźne przejście strefy
hemolizy w podłoże niezmienione.

Hemoliza beta – wokół kolonii strefa zupełnego przejaśnienia podłoża.

Hemoliza gamma – brak zdolności hemolizy krwinek czerwonych (bakteria nie wytwarza hemolizy),
podłoże wokół kolonii niezmienione.

Metody współczesne:

1. System API:

- opracowany przez firmę BioMerieux, obejmuje szereg zestawów do ukierunkowanej
identyfikacji
chorobotwórczości bakterii na podstawie charakterystycznych aktywności biochemicznych.

- biochemiczny szereg identyfikacji API ma postać paska z tworzywa sztucznego, w którym
wytłoczone są
mikroprobówki

- każda mikroprobówka zawiera odpowiedni, odwodniony substrat, który zostaje uwodniony
przez
wprowadzenie pipetą zawiesiny badanych bakterii

- do inkubacji paska w cieplarce służy indywidualna komora inkubacyjna, zapewniająca
właściwą wilgotność

- reakcje biochemiczne zachodzące w czasie inkubacji powodują zmiany zabarwienia
(samoistnie lub po
dodaniu odpowiedniego indykatora)

- do odczytu służy specjalna tabelka informująca o sposobie dokonania odczytu i zapisania
wyniku w postaci
kodu numerycznego

20

- w karcie wyniku, testy podzielono na grupy po 3, a wartości 1,2 lub 4 odpowiadają
dodatniemu wynikowi
reakcji w każdej grupie

- jeśli szereg API zawiera 20 testów, to dodając liczby w każdej grupie otrzymuje się kod
numeryczny 7-
cyfrowy

- korzystając z książki kodów API i programu API LAB można dokonać identyfikacji nazwy
gatunku, do którego
należy badana bakteria

Testy API opracowano dla różnych grup drobnoustrojów

2. Metody Enterotube:

- służą do różnicowania drobnoustrojów w obrębie rodziny Enterobacteriaceae – wysiewamy
badany szczep
na kilku pożywkach znajdujących się w jednej probówce

- wnętrze probówki podzielone na 8-12 części, w których znajdują się podłoża umożliwiające
określenie cech
biochemicznych (ilość i rodzaj tych podłóż zależy od producenta testu)

- posiew wykonuje się najczęściej za pomocą ezy, przeciągając ją jednym ruchem przez kolejne
podłoża w
probówce

- inkubacja przez 24 lub 48h w odpowiedniej temperaturze

- na postawie zmian w zabarwieniu pożywek oznacza się właściwości biochemiczne badanego
szczepu, co
pozwala na jego identyfikację

3. Komputerowe systemy identyfikacji bakterii i i automatyzacji.

Mikrobiologia Ćw. 7

Identyfikacja bakterii metodami serologicznymi

(odczyn aglutynacji, aglutynacji pośredniej, precypitacji)

Określanie typu bakteriologicznego

Kiedy stosujemy identyfikację serologiczną?

- cechy morfologiczne

- sposób barwienia się

- ruch lub jego brak

- właściwości biochemiczne

Kiedy wszystkie wymienione nie stanowią dostatecznego kryterium do różnicowania mikroorganizmów

21

Identyfikacja serologiczna – swoista reakcja między nieznanym antygenem (zarazkiem) i znaną
surowicą diagnostyczną (przeciwciałem)

Swoistość rekcji – wyraża się tym, że dany antygen reaguje tylko i wyłącznie z tym przeciwciałem,
które powstało pod jego wpływem.

Antygen – każda substancja, która rozpoznana przez organizm jako obca, uruchamia odpowiedź
immunologiczną i reaguje swoiście z jej produktami (przeciwciała, uczulone limfocyty T) in vitro i in
vivo.

Przeciwciała – swoiste białka powstające podczas odpowiedzi układu immunologicznego na antygen i
reagujące swoiście tylko z tym antygenem, pod wpływem którego powstały in vivo i in vitro.

Surowice diagnostyczne – uzyskujemy w wyspecjalizowanych wytwórniach przez uodparnianie
zwierząt znanym antygenem, w wyniku czego pojawiają się w ich surowicach przeciwciała skierowane
przeciwko temu antygenowi.

W identyfikacji serologicznej mieszamy badany nieznany antygen (zarazek), kolejno z różnymi
surowicami diagnostycznymi i obserwujemy, z którą z nich wystąpi określona reakcja dodatnia (
aglutynacji, precypitacji itp.). jej wystąpienie świadczy o identyczności badanego zarazka z tym, który
był przyczyną powstania swoistych przeciwciał

W wyniku reakcji zachodzącej między antygenem i przeciwciałem powstaje kompleks antygen-
przeciwciało, którego charakter zależy od postaci antygenu.

Antygeny upostaciowione (np. komórki) tworzą kompleksy w formie aglutynatu (reakcja aglutynacji),
antygeny rozpuszczalne, nieupostaciowione (białka, wielocukry) tworzą kompleksy w postaci strątu –
precypitatu (reakcja precypitacji).

Odczyn aglutynacji (zlepienia):

- odczyn dwufazowy – w pierwszej fazie następuje swoiste wiązanie się antygenu z przeciwciałem,
w drugiej, w
obecności elektrolitów, dochodzi do wypadania powstałego kompleksu z roztworu.

- najczęściej używanym odczynem jest aglutynacja szkiełkowa (można wykonać probówkową).

- na szkiełko podstawowe nanosimy kroplę surowicy diagnostycznej i obok kroplę płynu fizjologicznego
(kontrola).
Do obu kropel wprowadzamy małą ilość badanej hodowli bakteryjnej i rozprowadzamy, aż do
uzyskania jednolicie
mętnej zawiesiny, następnie ruchem okrężnym mieszamy składniki reakcji.

- wynik dodatni – po 1-3 min. przejaśnienie płynu i pojawienie się kłaczków lub ziarnistości

- kontrola lub wynik ujemny – mieszana zawiesina pozostaje jednolicie mętna.

Odczyn precypitacji (strącania):

- odczyn dwufazowy – w pierwszej fazie następuje swoiste wiązanie się antygenu z przeciwciałem, w
drugiej fazie w
obecności elektrolitów, dochodzi do wypadania powstałego kompleksu z roztworu.

- bardzo czuły, umożliwiający wykrycie śladowych ilości substancji antygenowej

- in vitro stosowany w diagnostyce wąglika, wykrywaniu toksyn, określenia stereotypów paciorkowców,
wykrywania

22

zafałszowań mięsa (badanie swoistości gatunkowej białka), w medycynie sądowej (ustalanie
pochodzenia plam
krwi)

- in vivo – powstające kompleksy precypitacyjne odgrywają istotną rolę w patogenezie wielu zjawisk
alergicznych

- odczyn precypitacji można przeprowadzać w środowisku płynnym i stałym (żel)

- precypitację w żelu można wykonać w dwóch układach, jako dyfuzję pojedynczą (prostą) i podwójną.

Precypitacja pojedyncza (prosta):

- badana substancja dyfunduje do żelu, zawierającego znaną surowicę diagnostyczną. W miejscu
optymalnego
stężenia kompleksów immunologicznych (antygen-przeciwciało) powstają prążki precypitacyjne.

Precypitacja podwójna:

- oba składniki dyfundują ku sobie (surowica i antygen). W miejscu optymalnego stężenia kompleksów
immunologicznych powstają prążki precypitacyjne.

Dyfuzja radialna – antygen dyfunduje z basenika do żelu zawierającego surowicę diagnostyczną.
Dodatni wynik – pojawia się powstaniem pierścienia precypitacyjnego wokół basenika (im więcej
antygenu, tym szerszy pierścień precypitacyjny).

Precypitacja pierścieniowa – na surowicę, wprowadzaną do probówki lub kapilary, nawarstwiamy
badany wyciąg antygenowy. W przypadku obecności odpowiednich antygenów w wyciągu powstaje na
granicy płynów w ciągu kilku min. wyraźny pierścień precypitacyjny.

Odczyn aglutynacji biernej (pośredniej):

- łączy w sobie cechy odczynów precypitacji i aglutynacji – antygen nieupostaciowany łącząc się z
przeciwciałem
(surowicą diagnostyczną) zaadsorbowanym na nośniku (bantoinit, lateks, węgiel), powoduje ich
aglutynację. Jeśli
nośnikiem jest krwinka czerwona odczyn określamy mianem hemoaglutynacji biernej (pośredniej).

Określanie typu bakteriologicznego:

Bakteriocyny:

- białkowe antybiotykopodobne substancje, wytwarzane przez niektóre szczepy bakterii G+

- wywierają działanie bakteriobójcze na inne szczepy danego gatunku lub blisko z nim spokrewnionego

- bakteriocyny wytwarzane przez pałeczki jelitowe zwane są kolicynami. Wrażliwość drobnoustroju na
daną kolicynę
uwarunkowana jest istnieniem w ścianie komórkowej specyficznych dla tej kolicyny receptorów.

Badanie przynależności do określonego typu:

- na specjalne podłoże posiewamy w linii średnicy płytki badany szczep, a po 16h inkubacji (produkcja
bakteriocyn),
inaktywujemy go chloroformem i spłukujemy z podłoża

- prostopadle do linii pierwszego posiewu wysiewamy określone szczepy wskaźnikowe i po inkubacji
odczytujemy
wynik – dodatni zahamowanie wzrostu szczepu wskaźnikowego.

23

Mikrobiologia Ćw.8

Identyfikacja bakterii metodami serologicznymi

(immunofluorescencja, immunoperoksydazowy, seroneutralizacji, OWD, ELISA)

Lizotypia. Badania biologiczne na zwierzętach.

Odczyn seroneutralizacji (SN) – zobojętniania:

- zobojętnianie czynnika chorobotwórczego (antygenu) przez dodanie do niego przeciwciała (surowica
diagnostyczna)

- odczyn przebiegający w dwu fazach: in vitro i in vivo.

- zobojętnianie wykonane in vitro wyrażające się utratą patogenności, sprawdzamy in vivo na
zwierzętach
doświadczalnych (lub innych wrażliwych obiektach biologicznych – test zastosowany w wirusologii)

- w bakteriologii stworzony najczęściej do wykrywania i identyfikacji toksyn bakteryjnych

Odczyn wskaźnika dopełniacza (OWD):

- używany np. do rozpoznawania pałeczek Brucella tzw. odczyn Holta

Odczyn immunofluorescencji (IF):

- reakcja nieznanego antygenu z koniugatem – przeciwciałem znakowanym barwnikiem fluoryzującym
(fluorochromem) np. izocyjaninem fluoresceiny, rodaniną, oranżem akrydyny

- można wykrywać antygeny w tkankach, wydzielinach, wydalinach itp.

FITC – izocyjanin fluorosceiny, po wzbudzeniu emituje kolor zielony

TRITC – izocyjanin tetrametylorodaniny, po wzbudzeniu emituje kolor czerwony

Metoda bezpośrednia:

- badany materiał ( np. rozmaz) nawarstwiamy surowicą diagnostyczną znakowaną fluorochromem,
płuczemy w celu
usunięcia przeciwciał niezwiązanych z antygenem i oglądamy w mikroskopie fluorescencyjnym.
Koniugat związany z
antygenem świeci zwykle zielonkawym lub żółto-czerwonym światłem.

Metoda pośrednia:

- badany materiał pokrywamy najpierw surowicą diagnostyczną nieznakowaną i po spłukaniu
nawarstwia się po raz
drugi znakowanymi przeciwciałami dla białka surowicy diagnostycznej (np. jeśli surowica
nieznakowana była
pochodzenia króliczego, koniugatem będzie przeciwciało dla białka królika – antyglobulina)

- metoda pośrednia jest tańsza niż bezpośrednia – pozwala wykrywać jedną antyglobuliną znakowaną
wiele
antygenów

24

- metoda bezpośrednia wymaga znakowanych surowic diagnostycznych dla każdego z poszukiwanych
antygenów

Odczyn immunoenzymatyczny (IE) (np. immunoperoksydazowy – IP):

- oparty na tej samej zasadzie co odczyn IF, z tą różnicą, że przeciwciało znakowane jest enzymem
(np. peroksydazą
chrzanową, alkaliczną fosfatazą) powstały kompleks antygen-przeciwciało wykrywa się za pomocą
substratu dla
enzymu – chromogenu (np. odczynnik benzydynowy, którego utlenione złogi są widoczne w
preparacie w postaci
niebieskobrunatnych plam.

- odczyn ten pozwala na wykazanie antygenu przy użyciu zwykłego mikroskopu

Odczyn ELISA (Enzyme- Linked Immunosorbent Assay):

- odczyn zaliczany do immunoenzymatycznych, różni się od testu peroksydazowego tym, że
przeciwciało (lub
antygen – w badaniach serologicznych) jest trwale zaadsorbowany na odpowiednim nośniku
(polistyrenie,
polichlorku winylu itp.)

- metoda wysoce czuła, łatwa w wykonaniu, znajduje coraz szersze zastosowanie w mikrobiologii, a
zwłaszcza w
badaniach wirusologicznych i immunologicznych

Metoda testem ELISA w kierunku wykrywania np. toksyn bakteryjnych:

- adsorpcja swoistej surowicy antytoksycznej – antytoksyny (przeciwciała przeciwko toksynie) na
nośniku

- wypłukanie niezaadsorbowanych przeciwciał

- wprowadzenie materiału badanego na obecność toksyn. W razie ich obecności powstają kompleksy
przeciwciało
(antytoksyna) – antygen (toksyna)

- usunięcie niezwiązanego antygenu

- dodanie koniugatu (przeciwciało znakowane enzymem), skierowanego przeciwko powstałemu
kompleksowi

- wykrycie powstałego kompleksu – dodanie substratu odpowiedniego dla enzymu i pomiar, np.
spektrofotometryczny natężenia reakcji

Lizotypia:

- podstawa lizotypii – różnice wrażliwości określonych szczepów bakterii na zakażenie różnymi
gatunkami
bakteriofagów

- bakteriofagi – wirusy, które namnażają się tylko na wrażliwych bakteriach, powodując ich
rozpuszczanie (lizę) –
zmniejszenie zmętnienia hodowli płynnej lub powstanie na bardzo gęsto posianym podłożu stałym
ubytków,
zwanych „łysinkami”

25

- jednym z głównych czynników decydujących o wrażliwości na dany bakteriofag jest antygenowa i
chemiczna
budowa powierzchni komórki bakteryjnej

- w przyrodzie istnieją fagi o małej swoistości – atakują kilka gatunków bakterii oraz fagi o wysokiej
swoistości –
powodują lizę ściśle określonych szczepów

- fagi o wysokiej swoistości pozwalają na podział jednolitych pod względem biochemicznym, a nawet
serologicznym
gatunków na typy fagowe (np. Gronkowce, niektóre Salmonelle, Brucelle czy Klebsielle)

- lizotypia dzięki wysokiej czułości i swoistości znalazła zastosowanie w dochodzeniach
epidemiologicznych i
epizootiologicznych (np. wybuch dwu epidemii w dwu różnych miastach – jeśli to samo źródło –
bakterie izolowane
od chorych będą należeć do tego samego typu fagowego)

Wykonanie próby:

- bakterie do typowania muszą pochodzić z czystej hodowli

- próbę przeprowadzamy na podłożu stałym Harlteya

- na denku płytki Petriego z tym podłożem rysujemy dermatografem siatkę składającą się z określonej
liczby
kwadratów

- podłoże zalewamy 4-5 godzinną hodowlą bulionową drobnoustrojów (4 skala McFarlanda)

- posianą płytkę suszymy z uchylonym wieczkiem przez 15-20 min. w cieplarce

- do poszczególnych kratek wkraplamy odpowiednio rozcieńczone (RTD- rutine test dilution) zestawy
bakteriofagów

- po wyschnięciu kropel posiew płytki inkubuje się w 37°C przez 4-6h, a następnie przez noc w
temperaturze
pokojowej

- w efekcie posiewu cała powierzchnia płytki pokrywa się zlewającymi się koloniami bakteryjnymi
(„gazon bakterii”),
a w poszczególnych kratkach pojawiają się w gazonie, różnej wielkości i liczby łysinki

Ocena wyników:

- zależy od stopnia lizy – np. przy typowaniu gronkowców – powstanie więcej niż 50 łysinek lub
całkowita liza w
miejscu wkroplenia fagów oznacza silny odczyn – dodatni, mniej niż 50 łysinek to słaby odczyn –
ujemny

- wszystkie fagi, które spowodowały silny odczyn, wyznaczają wzór fagowy danego szczepu, np.
7/47/53/54/75 (fagi
używane do typowania określone są zwykle odpowiednimi cyframi

Badanie biologiczne na zwierzętach:

26

Cel wykonywania:

- izolacja chorobotwórczych drobnoustrojów – z silnie zakażonego materiału w organizmie zwierzęcia
doświadczalnego następuje namnożenie tylko zarazków patogennych. Po jego śmierci z narządów
wewnętrznych
można izolować czystą hodowlę

- badanie na obecność toksyn – np. na trzech parach myszek na obecność toksyny botulinowej; na
kotach na
obecność enterotoksyny gronkowcowej itp.

- różnicowanie gatunków pokrewnych – np. włoskowca różycy i Listerii (pierwszy niechorobotwórczy
dla świnki
morskiej, zjadliwy dla gołębia; drugi nie wywołuje choroby u gołębia, lecz jest patogenny dla świnki
morskiej)

- wykazanie chorobotwórczości i zjadliwości – stopień zjadliwości określa się najmniejszą dawkę
zarazka powodującą
u 50% zarażonych zwierząt choroby (ID50) lub śmierć (LD50)

Zwierzęta używane do prób biologicznych:

- tanie

- małe zwierzęta laboratoryjne (myszy, szczury, świnki morskie, króliki, wyjątkowo zwierzęta
gospodarskie)

- zdrowe

- o wyrównanej kondycji i wieku

- dobrane pod względem wrażliwości na dany drobnoustrój

Badany materiał wprowadza się , zależnie od tropizmu zarazka (najczęściej podskórnie, dootrzewnowo,
domięśniowo, niekiedy przez skaryfikację skóry lub doustnie), określonej licznie osobników

W celu eliminacji wpływu zakażeń bezobjawowych lub nabytej odporności na wyniki badań, zamiast
zwierząt konwencjonalnych używamy zwierząt gnotobiotycznych – wiadomo jaka flora (bakterie i
wirusy) i fauna (pierwotniaki, pasożyty wyższe) je zasiedla.

Rodzaje zwierząt gnotobiotycznych:

- zwierzęta aseptyczne (bezbakteryjne i akseniczne) – pozbawione jakichkolwiek obcych organizmów

- zwierzęta gnotobiotyczne (w ścisłym sensie) – uzyskane z poprzednich przez sztuczne zasiedlenie ich
czystymi
kulturami jednego lub kilku gatunków drobnoustrojów

- zwierzęta SPF (Specific Pathogens Free) – posiadają normalną florę bakteryjną, ale są wolne od
określonych
zarazków chorobotwórczych

W badaniach rutynowych zwierzęta te nie znajdują zastosowania – wysokie koszty (otrzymywanie tych
zwierząt i ich chów wymagają specjalnej techniki, dużego nakładu finansowego i aparaturowego

Podstawa oceny wyników badań biologicznych:

-charakterystyczne objawy chorobowe, np. tężca, botulizmu

- typowe zmiany w tkankach i narządach

27

- mikroskopowe wykazanie zarazków w zakażonym organizmie

Przy braku objawów chorobowych – po pewnym czasie zwierzę badamy: serologicznie – wykazanie
obecności w surowicy, swoistych dla danego zarazka przeciwciał lub alergicznie (np. po zakażeniu
prątkami gruźlicy).

Mikrobiologia Ćw.9

Oznaczanie wrażliwości bakterii na chemioterapeutyki, barwniki i fitoncydy.

Oznaczanie liczby bakterii metodą Kocha i McFarlanda.

Ogólne badanie biologiczne wody.

Badanie wrażliwości bakterii na chemioterapeutyki – antybiogram:

Antybiogram – opis danego zarazka na działanie określonych chemioterapeutyków.

Podstawa racjonalnej chemioterapii – określanie wrażliwości badanego zarazka na dostępne leki i
użycie takiego z nich, który w najmniejszej dawce, daje najlepszy efekt oraz wykazuje możliwie wąskie
spektrum działania.

Metody – określanie wrażliwości drobnoustrojów na chemioterapeutyki:

- rozcieńczeń probówkowych

- dodawanie leku do pożywki

- dyfuzyjno-krążkowa

Metoda dyfuzyjno-krążkowa:

- określenie na podłożu stałym wielkości strefy zahamowania wzrostu badanego zarazka dookoła
ułożonych na
podłożu krążków bibułowych nasyconych znaną ilością danego chemioterapeutyku

- strefy zahamowania są z reguły proporcjonalne do wrażliwości danego mikroorganizmu na określony
chemioterapeutyk – im bardziej wrażliwy zarazek, tym większa strefa hamowania

- badanie przeprowadzamy na podłożu Mueller-Hintona

- krążki bibułowe zawierające odpowiednie antybiotyki, odpowiednio oznaczone i jałowe, nabywane są
u
producenta.

Wykonanie próby:

- na płytkę Petriego (10 cm średnicy) wylewamy 30 cm

3

podłoża

- przed posiewem płytki podduszamy przez 30 min. w cieplarce (37°C)

- na środek podłoża nanosimy kroplę odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny badanego drobnoustroju (4
skala
McFarlanda) i jałową bagietką szklaną rozprowadzamy po całej powierzchni podłoża

28

- wyjałowionymi szczypczykami układamy na podłożu krążki bibułowe

- odległość między krążkami powinna wynosić nie mniej niż 2 cm

- płytki wstawiamy do cieplarki – chemioterapeutyki dyfundują do podłoża i hamują w większym lub
mniejszym
stopniu wzrost posianego zarazka – powstają wokół krążków strefy zahamowania wzrostu bakterii.

- czas inkubacji – 12-18h (za długa inkubacja – inaktywowanie się leku – wtórne wzrosty, zbyt krótka
inkubacja –
niedostateczna dyfuzja)

- odczytanie wyniku polega na zmierzeniu średnicy stref zahamowania wzrostu

- wielkość stref zahamowania wzrostu, będąca podstawą do określenia stopnia wrażliwości zarazka
(wrażliwy, słabo
wrażliwy, oporny), jest różna dla poszczególnych chemioterapeutyków i określona przez producenta
krążków

- konieczne jest wykonanie badania kontrolnego z odpowiednim szczepem wzorcowym bakterii (brak
stref
zahamowania wzrostu – świadczy o inaktywowaniu się chemioterapeutyku w krążku i jego
nieprzydatności).

Wrażliwość bakterii na barwniki:

- niektóre barwniki – fiolet krystaliczny, błękit metylenowy, zieleń brylantowa, fuksyna zasadowa mogą
wywierać
hamujący wpływ na wzrost drobnoustrojów

- działają bakteriostatycznie (hamują namnażanie), a w większych stężeniach bakteriobójczo (śmierć
bakterii)

- wykorzystanie praktyczne barwników :

 Do sporządzania podłoży wybiórczych (fiolet krystaliczny hamuje wzrost bakterii G+ i stwarza

warunki do namnożenia bakterii G-)

 Roztwory niektórych barwników znajdują zastosowanie jako leki przeciwbakteryjne do

stosowania miejscowego (pioktanina, błękit metylenowy, zieleń brylantowa)

 Najsilniej antyseptycznie działają pochodne akrydynowe, np. rywanol, proflawina

Wrażliwość bakterii na fitoncydy:

- fitoncydy – lotne związki o charakterze olejków eterycznych, różnorodne pod względem
chemicznym, antybiotyki wyższych roślin o działaniu bakterio-, grzybo- i pierwotniakobójczym

- fitoncydy występują w takich roślinach jak: czosnek, cebula i chrzan. Związki zawarte w czosnku
mają największe
znaczenie i najsilniej działają: są zabójcze dla drobnoustrojów G+ i G-, a także dla
antybiotykoodpornych
drobnoustrojów występujących w jelitach podczas biegunki u dzieci

Badanie ilościowe:

Nie stanowi elementu toku rozpoznawczego!!!!

Cel oznaczania liczby bakterii:

- ocena stopnia zanieczyszczenia bakteryjnego badanej próby (np. produktu spożywczego)

29

- oznaczanie gęstości zawiesiny bakterii w trakcie produkcji szczepionek, antygenów diagnostycznych
itp.

Oznaczamy:

- całkowitą liczbę bakterii żywych i martwych

 Metody bezpośrednie
 Metody pośrednie

- całkowitą liczbę bakterii żywych

Metody bezpośrednie:

- liczenie w badanym preparacie mikroskopowym znanej objętości zawiesiny bakteryjnej

- liczenie bakterii w specjalnych komorach, np. do liczenia krwinek

Metody pośrednie:

- metoda Wrighta – po zmieszaniu równych objętości zawiesiny bakteryjnej i krwinek, np. psa,
sporządzamy preparat
i oznaczamy ich stosunek ilościowy (jeśli w polu widzenia mikroskopu przypadły średnio na jeden
erytrocyt 3
bakterie, to liczba bakterii wynosi ok. 18 mln/ml [3x6 – średnia liczba erytrocytów w 1 ml krwi psa])

- metoda McFarlanda (Nefelometria) – porównywanie zmętnienia zawiesiny bakteryjnej ze
zmętnieniem
odpowiedniego standardu – skalą McFarlanda, odpowiadającym widocznej liczbie bakterii. Skala
składa się z
szeregu 10 probówek o różnym zmętnieniu siarczanu baru odpowiadającemu określonej liczbie
komórek bakterii
Serratia marcescens.

Metoda płytkowa Kocha:

Metoda oznaczania całkowitej liczby bakterii żywych.

Założenie: każda żywa bakteria wytwarza na podłożu stałym jedną kolonię!!!

Oznaczanie rozpoczynamy od sporządzenia rozcieńczeń – do szeregu probówek rozlewamy po 8 ml
NaCl i do pierwszej wprowadzamy pipetą 1 ml badanej zawiesiny. Następnie świeżą pipetą mieszamy
zawartość tej probówki przez 3-krotnie zassanie i wydmuchanie. Otrzymujemy rozcieńczenie 1:10,
którego 1 ml przenosimy do następnej probówki. Zmieniamy pipetę, mieszamy i otrzymujemy
rozcieńczenie 1:100. Postępując analogicznie z dalszymi probówkami uzyskujemy rozcieńczenie
1:1000, 1:10 000.

Metoda płytkowa Kocha:

Z przygotowanych 10-krotnie wzrastających rozcieńczeń badanego materiału wysiewamy zaczynając
od najwyższego po 0,1 ml na dwie płytki i rozprowadzamy po powierzchni agaru wyjałowioną bagietką
szklaną. Po inkubacji liczymy wyrosłe na pożywce kolonie. Do liczenia nadają się najlepiej płytki
zawierające najmniej 30 kolonii.

Przykład: przy wysiewie 0,1 ml zawiesiny rozcieńczonej 1:10 000 uzyskano na jednej płytce wzrost 50,
na drugiej 54, czyli średnio 52 kolonie. Jeden mililitr nierozcieńczonej zawiesiny 10 000 razy więcej,
czyli 5200 000 bakterii (10

6,7

– 6 to cecha [ilość cyfr w danej liczbie minus 1], 7 to mantysa wskazuje

liczbę).

30

Oznaczanie miana drobnoustrojów:

- miano – najmniejsza ilość lub największe rozcieńczenie badanej próby, w której stwierdza się jeszcze
obecność
określonych bakterii (np. pałeczek okrężnicy – tzw. miano coli)

- metoda polega na sporządzeniu 10-krotnie wzrastających rozcieńczeń próby i wysianiu ich łącznie z
nierozcieńczoną próbą, na podłoża płynne, wybiórczo-różnicujące, zawierające substraty, których
rozkład wyraża się
zmianą zabarwienia podłoża. Najwyższe rozcieńczenie, w którym nastąpił wzrost badanego
drobnoustroju –
ostatnia probówka w rzędzie ze zmianą barwy, określa miano próby

- metoda często stosowania w mikrobiologii żywności do oceny mikrobiologicznej niektórych artykułów
spożywczych. Jeśli w badanym produkcie (np. wodzie pitnej, napojach) liczba określonych bakterii
przekroczy
dopuszczalną normę – nieprzydatny do spożycia.

Badanie bakteriologiczne wody:

- źródłem zanieczyszczeń bakteryjnych wody są przeważnie ścieki zawierające odchody ludzkie i
zwierząt. Ze względu
na to, że E.coli jest stałym składnikiem mikroflory jelitowej, przyjęto jej obecność w wodzie za
wskaźnik
zanieczyszczeń

- rutynowo stosowane są dwie podstawowe metody:

 Metoda filtrów membranowych (FM):

Odpowiednią objętość wody (100, 10, 1 lub 0,1) sączymy przez filtry membranowe
zatrzymujące bakterie i nakładamy je, bakteriami do góry, na płytkę Endo, a po inkubacji (22 h)
w temperaturze 37°C liczymy kolonie grupy E. coli (ciemnoczerwone zabarwienie i metaliczny
połysk). Obliczamy WSKAŹNIK COLI – liczba bakterii grupy coli w 100 ml badanej wody:
Liczba typowych kolonii x 100 / ilość ml filtrowanej wody

 Metoda fermentacyjno-probówkowa (FP):

Polega na powiewie odpowiedniej objętości wody (50, 10, 1 lub 0,1 ml) do płynnego podłoża
zawierającego laktozę. Wynik dodatni świadczący o obecności E.coli w badanej objętości
uwidacznia się po 24-48 h inkubacji w temperaturze 37°C silnym zakwaszeniem podłoża i
powstaniem gazu w rurce fermentacyjnej. Końcowy wynik badania przedstawiamy w postaci
miana i odpowiadającej mu Najbardziej Prawdopodobnej Liczby (NPL) bakterii w 100 ml.
Normy dla obu wskaźników odczytuje się ze specjalnych tablic.