1

Badania serologiczne w
diagnozowaniu ostrych
zaka

ż

e

ń

wirusowych

Maciej Przybylski

Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej WUM

Przydatno

ść

metod serologicznych (1)

Gdy wykrycie przeciwciał daje miarodajn

ą

informacj

ę

na temat

przyczyny objawów

zaka

ż

enie rzadkie w populacji (niski „poziom tła”)

czas potrzebny do wytworzenia przeciwciał – zaka

ż

enia o

długim czasie inkubacji, zaka

ż

enia przewlekłe

du

ż

a szansa,

ż

e jest to zaka

ż

enie pierwotne (zaka

ż

enia u

małych dzieci – ocena serokonwersji)
zaka

ż

enie

≡

zachorowanie

Gdy nie ma mo

ż

liwo

ś

ci wykonania bada

ń

bezpo

ś

rednich

wirus trudny w hodowli
wirus niebezpieczny
trudno

ś

ci w dotarciu do ogniska zaka

ż

enia

miano wirusa w materiale klinicznym poni

ż

ej progu

wykrywalno

ś

ci rutynowych metod diagnostyki bezpo

ś

redniej

Badania epidemiologiczne

ocena stanu zaka

ż

enia populacji – badania serologiczne na

reprezentatywnej grupie
ocena skuteczno

ś

ci szczepie

ń

•

badania serologiczne populacji

•

wyznaczenie miana ochronnego

•

ocena odpowiedzi poszczepiennej

Specyficzne sytuacje kliniczne

potwierdzenie zaka

ż

enia wrodzonego – IgM u noworodka

badania serologiczne biorców i dawców przeszczepów

Przydatno

ść

metod serologicznych (2)

Badania serologiczne w
rozpoznawaniu zaka

ż

e

ń

Rutynowo wykonywane dla:

HIV

HAV

HBV

HCV

wirusa kleszczowego zapalenia mózgu

wirusów gor

ą

czek krwotocznych

Diagnostyka serologiczna ostrych
zaka

ż

e

ń

wirusowych

wirusowe choroby wieku dzieci

ę

cego

zaka

ż

enia herpeswirusamiwirusami limfotropowymi:

mononukleoza zaka

ź

na (i inne formy zaka

ż

e

ń

EBV)

CMV

HHV-6

serodiagnostyka zaka

ż

e

ń

OUN

wirusowe zapalenie wsierdzia i mi

ęś

nia sercowego

opryszczka narz

ą

dów płciowych

Wirusowe zapalenie mi

ęś

nia

sercowego

Diagnostyka:

badania serologiczne
wykrywanie wirusowych kwasów nukleinowych we krwi obwodowej
biopsja (ocena histopatologiczna, hybrydyzacja in situ, NAAT)

Czynniki brane pod uwag

ę

:

enterowirusy (wirusy Coxsackie)
wirusy parainfluenzy
wirusy grypy
CMV
EBV
HHV-6
parwowirus B19
wirus ró

ż

yczki

2

European Heart Journal
doi:10.1093/eurheartj/ehq493

Grupa badana: 124 pacjentów z objawami zapalenia mi

ęś

nia

sercowego

Badania histopatologiczne:

nasilone zmiany zapalne: 4 (3%)
lekki naciek: 40 (32%)
bez znamion stanu zapalnego: 70 (56%)

Badania serologiczne:

Badanie surowic parzystych (odst

ę

p mi

ę

dzy próbkami surowic 7-28

dni)
wykrywanie IgM, IgA oraz IgG
ocena dynamiki miana (4-krotny wzrost)

Badania bezpo

ś

rednie: wykrywanie wirusowych kwasów

nukleinowych w bioptatach mi

ęś

nia sercowego

Kryteria dla dodatniego wyniku bada

ń

serologicznych: wykrycie

swoistych IgM przynajmniej w jednej próbce surowicy lub wykrycie
znacz

ą

cego wzrostu miana IgA lub IgG

Wyniki bada

ń

serologicznych:

Dodatnie wyniki bada

ń

: 20 pacjentów (16%)

Wykryto przeciwciała przeciw:

enterowirusom (10)

adenowirusom (1)

parwowirusowi B19 (2)

CMV (3)

HHV-6 (3)

EBV (1)

Wyniki bada

ń

bezpo

ś

rednich (wykrycie

wirusowego DNA lub RNA w bioptacie)

Dodatnie wyniki: 58 pacjentów (47%)

Wykryte wirusy

Enterowirus 5 (4%)
Adenowirus 3 (2%)
Parwowirus B19 33 (27%)
CMV 0
HHV-6 10 (8%)
EBV 7 (6%)
zaka

ż

enie 2 lub wi

ę

cej wirusami 13 (10%)

Porównanie wyników bada

ń

serologicznych i wykrywania wirusowych
kwasów nukleinowych

Diagnostyka serologiczna zaka

ż

e

ń

EBV u osób dorosłych

Standardowy panel bada

ń

w diagnostyce

serologicznej EBV obejmuje wykrywanie

przeciwciał w klasach IgM, IgA oraz IgG

przeciwko

białkom kapsydu (VCA)

białku wczesnemu (EA)

antygenowi j

ą

drowemu EBV (EBNA)

Znaczenie diagnostyczne przeciwciał
przeciw EBV

VCA IgM: wska

ź

nik ostrej fazy zaka

ż

enia, pojawiaj

ą

sie jako pierwsze w

zaka

ż

eniu pierwotnym a tak

ż

e w przebiegu reaktywacji wirusa latentnego

VCA IgG: wska

ź

nik przebytego zaka

ż

enia, utrzymuja si

ę

latami

EA IgM: podobnie jak VCA IgM s

ą

markerem aktywnego zaka

ż

enia, pojawiaj

ą

sie w przebiegu infekcji pierwotnej i rzadko przy reaktywacjach. Reaktywno

ść

znacznie rzadsza w porównaniu z VCA IgM

EA IgG: charakterystyczne dla fazy zdrowienia. Wyst

ę

puj

ą

u niewielkiego

odsetka zaka

ż

onych

EBNA IgM: znaczenie nie w pełni okre

ś

lone. Prawdopodobnie zwi

ą

zane z

ustalaniem stanu latencji EBV

EBNA IgG: pojawiaj

ą

si

ę

stosunkowo pó

ź

no po wyzdrowieniu (~3 miesi

ą

ce),

utrzymuj

ą

si

ę

latami

3

Typowy wzór przeciwciał w
mononukleozie zaka

ź

nej

Najcz

ęś

ciej obserwowane wzory

przeciwciał swoistych wobec EBV

+

+/(-)

+/(-)

+/(-)

+

+

reaktywacja wirusa latentnego

+

(-)

(-)

(-)

+

(-)

zakażenie przebyte

+

+/(-)

+/(-)

(-)

+

+/(-)

zakażenie pierwotne

(rekonwalescencja)

(-)

+

+/(-)

+/(-)

(-)

+

ostre zakażenie pierwotne
(faza późna)

(-)

(-)

(-)

+/(-)

(-)

+

ostre zakażenie pierwotne
(faza wczesna)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

brak zakażenia

EBNA

IgG

EBNA

IgM

EA

IgG

EA

IgM

VCA

IgG

VCA

IgM

Przypadek I

Immunokompetentna osoba dorosła, ostra objawowa
reaktywacja wirusa latentnego

Limfohistiocytoza hemofagocytarna. Prawdopodobnie niedobory odporno

ś

ci

komórkowej. Przebieg ci

ęż

ki z naciekiem histiocytarnym w skórze i narz

ą

dach

wewn

ę

trznych, powa

ż

nymi zaburzeniami krzepni

ę

cia i uszkodzeniem w

ą

troby

Przypadek II

Diagnostyka serologiczna chorób
wieku dzieci

ę

cego (1)

Odra – badanie surowic parzystych, IgM ELISA, N=108

Pacjenci rozpoznani przez pediatr

ę

na podstawie obrazu

klinicznego

Pierwsza próbka surowicy pobrana w momencie pojawienia si

ę

wysypki, druga 14 dni pó

ź

niej

Wyniki:

dodatnie

ujemne „szara strefa”

Faza ostra choroby:

69

30

1

Faza zdrowienia:

95

4

1

JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Jan. 2000, p. 99–104

Diagnostyka serologiczna chorób
wieku dzieci

ę

cego (2)

Nagminne zapalenie przyusznic, N=155
Badanie serologiczne – pojedyncza próbka surowicy pobrana w
fazie ostrej choroby, wykrywanie swoistych IgM
Badania genetyczne (RT-PCR): wykrywanie wirusowego RNA w
próbkach sliny i moczu pobranych w fazie ostrej choroby
(równocze

ś

nie z surowic

ą

)

Wyniki:

wyniki

wyniki

dodatnie

ujemne

wirusowe RNA w

ś

linie

122

33

wirusowe RNA w moczu

66

89

swosite IgM w surowicy

38

117

Can J Infect Dis Med Microbiol 2009 Vol 20 (4)

4

Diagnostyka serologiczna w
reaktywacji VZV

Metody:

wykrywanie VZV DNA w surowicy – PCR w czasie
rzeczywistym (PCR)

metody serologiczne: wykrywanie swoistych przeciwciał,
badanie surowic parzystych, I próbka pobrana w 0-26 dniu od
wystapienia objawów, II próbka w 14-40 dniu od wyst

ą

pienia

objawów, minimalny odst

ę

p mi

ę

dzy próbkami: 14 dni

•

odczyn wi

ą

zania dopełniacza dla VZV IgG (CF)

•

odczyn immunofluorescencji po

ś

redniej dla VZV IgG (IFA)

•

ELISA dla VZV IgM w pierwszej próbce surowicy (IgM1)

•

ELISA dla VZV IgM w drugiej próbce surowicy (IgM2)

Wyniki

SWISS MED WKLY 20 08;138:47–51

Opryszczka narz

ą

dów płciowych

(ONP)

Rozpoznanie opiera si

ę

na:

objawach klinicznych

metodach bezpo

ś

rednich

metodach serologicznych

Objawy kliniczne

owrzodzenia

ś

luzówki lub skóry narz

ą

dów płciowych (mo

ż

liwa inna lokalizacja

zmian)

miejscowe powi

ę

kszenie w

ę

złów chłonnych

gor

ą

czka

dyzuria

Podobne objawy obserwuje si

ę

przy:

zaka

ż

eniu Chlamydia trachomatis

kandydiazach

kile

wrzodzie mi

ę

kkim

zaka

ż

eniach Klebsiella granulomatis

ś

wierzbie

urazach

alergiach

liszajcu

u wi

ę

kszo

ś

ci pacjentów zaka

ż

enie narz

ą

dów płciowych HSV-1/HSV-2 jest

bezobjawowe

Rozpoznanie na podstawie objawów klinicznych w
odniesieniu do wyników bada

ń

diagnostycznych

wykazało:

u 37% pacjentów ze zmianami „wysoce wskazuj

ą

cymi

na opryszczk

ę

” nie wykryto HSV metodami

bezpo

ś

rednimi (hodowla, PCR), byli te

ż

seronegatywni

u 50% pacjentów ze zmianami „nie wskazuj

ą

cymi na

opryszczk

ę

” wykryto HSV-1 lub HSV-2

CLIN MICROBIOL REV 1999, p. 1–8 Vol. 12, No. 1

Metody diagnostyczne

cytologia
(Tzank/Papanicolau)

izolacja wirusa w hodowli

wykrywanie antygenów
HSV

PCR, PCR w czasie
rzeczywistym

serologia

Typy opryszczkowego

zapalenia błon

ś

luzowych

i skóry narz

ą

dów

płciowych

bezobjawowe

zmiany pierwotne

nawroty/reaktywacje

5

Poziom serokonwersji HSV-1/HSV-2
w grupach wiekowych

Diagnostyka na podstawie wyników
bada

ń

serologicznych

Zaka

ż

enie pierwotne: „okienko serologiczne” mo

ż

e trwa

ć

kilka

tygodni

okres wyl

ę

gania objawowego zaka

ż

enia HSV-1/HSV-2 ~ 7-20 dni.

Zaka

ż

enie wynikaj

ą

ce z reaktywacji:

A% zaka

ż

onych (dodatni wynik serologii)

z tego B% ulega latencji,

z tego C% ulega reaktywacjom

z tego D% przebiega z objawami

Około 20% pacjentów z przeciwciałami przeciw

HSV-2 nie wykazuje objawów zaka

ż

enia lub

zmiany s

ą

trudne do zaobserwowania. U 60%

pacjentów serododatnich objawy zaka

ż

enia

nie s

ą

rozpoznawane przez lekarzy ani

pacjentów jako zmiany wywołane przez
wirusa opryszczki.

Wykrycie przeciwciał umo

ż

liwia postawienie

diagnozy w przypadkach, w których metody
wirusologiczne (izolacja wirusa, wykrywanie
antygenów lub PCR) s

ą

niepraktyczne lub

daj

ą

wyniki ujemne.

CLIN MICROBIOL REV 1999, p. 1–8 Vol. 12, No. 1

Czuło

ść

metod bezpo

ś

rednich (1)

Przykład I

36,471 próbek,

z 1087 próbek wyizolowano w hodowli HSV (3,0%)

ale: 12% je

ż

eli były zmiany i 1,7% je

ż

eli nie było zmian

w 4415 próbkach wykryto DNA HSV (12%)

ale: 37% je

ż

eli były zmiany i 8,4% je

ż

eli nie było zmian

(JID 2003:188)

Przykład II

HSV-1 wykryto w 26 (24%) ze 110 próbek (qPCR) i w 24 (22%) metod

ą

izolacji w hodowli

HSV-2 wykryto w 40 (36%) ze 110 próbek (qPCR) i w 30 (27%) metod

ą

izolacji w hodowli

(HSV-1 + HSV-2 = 66%)

(Journal of Clinical Virology 29, 2004, 120–126)

Czuło

ść

metod bezpo

ś

rednich (2)

71%

34%

Wykrycie wirusa w

przypadku
reaktywacji

78

63

Reaktywacje
(% pacjentów)

61%

65%

Wykrycie wirusa przy

braku objawów

87%

72%

Wykrycie wirusa w

typowym materiale

Pacjenci z objawami

Pacjenci “bez

uprzedniej historii

ONP”

NEJM March 23, 2000 884-850

Stosowane metody
serologiczne:

HSV Ig EIA (jako

ś

ciowe, nie

ró

ż

nicuje typów wirusa)

HSV-1, HSV-2 IgG EIA
(jako

ś

ciowe)

point-of-care
(immunobloting, ró

ż

nicuje

HSV-1 i HSV-2, jako

ś

ciowe)

HSV-1 IgM, HSV-2 IgM
(jako

ś

ciowe)

Przydatno

ść

metod

serologicznych:

pacjent ma objawy

mo

ż

na u

ż

y

ć

metod

bezpo

ś

rednich do

wykrycia wirusa

pacjent bezobjawowy

nie ma mo

ż

liwo

ś

ci

diagnostyki
bezpo

ś

redniej

TAK albo nie wiadomo

TAK

NIE

nie wiadomo (okienko, zak.
bezobjawowe)

NIE

NIE

TAK (okienko)

NIE

TAK

TAK

TAK

TAK

pacjent ma opryszczkę
narządów płciowych

przeciwciała w surowicy

Wirus wykryty w zmianach

6

Konkluzja

1.

Ocena wyników serologii w kontek

ś

cie innych danych na temat pacjenta:

objawy (lub brak)

wywiad z pacjentem i partnerem (partnerami)

czy wyst

ę

puje promiskuityzm

ocena populacji, z której pochodzi pacjent jako wysokiego lub niskiego ryzyka

ko

ń

cowa ocena „wysokiego lub niskiego prawdopodobie

ń

stwa

przedtestowgo”

po czym nast

ę

puje wykrycie przeciwciał (lub niewykrycie)

(Australian Family Physician Vol. 34, No. 12, December 2005 )

2.

Metody serologiczne s

ą

niezalecane w diagnozowaniu opryszczki narz

ą

dów

płciowych, nale

ż

y u

ż

ywa

ć

najczulszej i najbardziej swoistej z dost

ę

pnych metod

bezpo

ś

rednich. Edukacja pacjenta na temat rozpoznawania objawów (lokalizacja,

wygl

ą

d, rozwój i zej

ś

cie) ogranicza znacz

ą

co liczb

ę

pacjentów „zaka

ż

onych

bezobjawowo”

(Guidelines for the laboratory diagnosis of genital herpes in eastern European countries,
Eurosurveillance, 45, 2010)