314

www.postepybiochemii.pl

Katarzyna Łepeta
Anna Maria Łasica
Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-

-Krynicka

*

Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobio-

logii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszaw-

ski, Warszawa

*

Zakład

Genetyki

Bakterii,

Instytut

Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet

Warszawski, ul. Miecznikowa 1, 02-096

Warszawa; e-mail: [e-mail]

Artykuł otrzymano 28 marca 2012 r.

Artykuł zaakceptowano 20 czerwca 2012 r.

Słowa kluczowe: nowotwór, szczepionka

DNA, terapia genowa, wektor, LBV

Wykaz skrótów: APC (ang. antigen presenting

cell) — komórka prezentująca antygen; IL-2

(ang. interleukin 2) — interleukina 2; LBV (ang.

attenuated live bacterial vaccine) — atenuowane

żywe bakteryjne szczepionki; MHC (ang.

major histocompatibility complex) — główny

układ zgodności tkankowej; SPI1/2 (ang. Sal-

monella pathogenicity island 1 or 2) — wyspa

patogenności 1 lub 2 w komórkach Salmonella

Zastosowanie mikroorganizmów jako wektorów

w antynowotworowych terapiach genowych

STRESZCZENIE

T

erapia genowa stanowi potencjalną nową strategię leczenia chorób nowotworowych.

Aby dostarczyć transgen specyficznie do komórek nowotworowych, wymagane jest

zastosowanie odpowiedniego wektora. Do tej pory większość genowych terapii nowotwo-

rowych opierało się na wykorzystaniu różnych wektorów wirusowych. Bakterie takie jak

Salmonella, Clostridium lub niepatogenne Bifidobacterium selektywnie gromadzą się w gu-

zach

in vivo, co czyni je użytecznymi wektorami w terapii genowej nowotworów. Chociaż

mechanizm transferu DNA z bakterii do komórek ssaków nie jest całkowicie poznany ich

potencjał do dostarczania genów terapeutycznych do komórek nowotworowych wykazano

in vitro i in vivo. Praca przeglądowa prezentuje najnowsze osiągnięcia terapii genowej no-

wotworów z wykorzystaniem bakterii.

WPROWADZENIE

Jednym z głównych problemów konwencjonalnych terapii antynowotworo-

wych jest brak specyficzności leków wobec komórek nowotworowych, czego

skutkiem jest ich toksyczność wobec wszystkich komórek, zarówno rakowych,

jak i tych zdrowych. Dlatego badania dotyczące terapii antynowotworowych

koncentrują się na poszukiwaniu metody, która umożliwiłaby selektywne dzia-

łanie leków na komórki guza. Od około 20 lat prowadzone są intensywne ba-

dania dotyczące zastosowania antynowotworowych terapii genowych. Terapie

te można zaklasyfikować do sześciu kategorii: terapie samobójcze (ang. suicide-

-gene therapy), terapie mające na celu przywrócenie właściwego cyklu komór-

kowego poprzez dostarczenie prawidłowych kopii uszkodzonych genów (ang.

corrective gene addition), terapie immunomodulujące, terapie blokujące procesy

angiogenezy, terapie powodujące wyciszanie genów oraz terapie onkolityczne.

Jako wektory dostarczające do komórek nowotworowych odpowiednie geny

stosowane były w początkowych badaniach głównie wektory wirusowe takie

jak adenowirusy, retrowirusy, HSV (ang. herpex simplex virus) oraz plazmidowy

DNA [1-3]. Także bakterie od wielu lat próbowano wykorzystywać w walce z

chorobami nowotworowymi. Od ponad 200 lat opisywane były przypadki re-

gresji chorób nowotworowych u pacjentów przechodzących infekcje bakteryjne,

np. już w 1813 roku odnotowano regresję nowotworu u pacjenta z objawami

zgorzeli gazowej spowodowanej infekcją Clostridium perfringens. Stosowano ce-

lowe infekcje, które w wielu przypadkach prowadziły do regresji lub całkowite-

go zaniku guza. Przykładem mogą być tzw. toksyny Coley’a (mieszanina zabi-

tych temperaturą komórek Streptococcus pyogenes i Serratia marcescens) stosowane

jako stymulatory układu odpornościowego w terapiach mięsaków [4,5]. W roku

1976 po raz pierwszy udokumentowano terapeutyczne działanie prątków BCG

(ang. Bacillus Calmette-Guerin) w leczeniu powierzchniowego raka pęcherza mo-

czowego (ang. superficial bladder cancer). Terapia ta stosowana jest do dzisiaj, choć

dopiero niedawno częściowo wyjaśniono mechanizm tego zjawiska [6]. Ponad-

to, prątki BCG są stosowane jako stymulujący adiuwant w kilku typach antyno-

wotworowych szczepionek np. OncoVAX czy CancerVax [7,8]. Wiele gatunków

bakterii preferencyjnie kolonizuje obszary guzów nowotworowych charaktery-

zujące się silnym niedotlenieniem. Rozwój inżynierii genetycznej pozwolił na

manipulowanie materiałem genetycznym mikroorganizmów i oszacowanie ich

skuteczności jako wektorów w antynowotworowych terapiach genowych. Bak-

terie stosowane jako nośniki genów w omawianych terapiach należą do trzech

grup: bakterie mlekowe z rodzaju Bifidobacterium, fakultatywne wewnątrzko-

mórkowe patogeny np. rodzaj Salmonella oraz ściśle beztlenowe bakterie ro-

dzaju Clostridium [9,10]. Jak dotąd nie udało się skonstruować bezpiecznego i

absolutnie skutecznego wektora do zastosowania w antynowotworowej terapii

genowej, powodującego zniszczenie wszystkich typów komórek nowotworo-

wych bez poważnych efektów ubocznych. Praca przeglądowa przedstawia osią-

gnięcia ostatnich lat dotyczące użycia żywych komórek bakteryjnych oraz spor

bakterii rodzaju Clostridium.

Postępy Biochemii 58 (3) 2012

315

MECHANIZM „

TUMOR-TARGETING” — SELEKTYWNA

KOLONIZACJA KOMÓREK NOWOTWOROWYCH

W toku wieloletnich badań udokumentowano, że różne

gatunki obligatoryjnych i fakultatywnych anaerobowych

mikroorganizmów preferencyjnie kolonizują i są zdolne se-

lektywnie replikować się w guzach litych, jeśli bakterie do-

starczane są ogólnoustrojowo. Powodem tej selektywności

są panujące wewnątrz guzów unikalne warunki. Rozwój

guza i przerzutów stymuluje angiogenezę czyli formowa-

nie nowych naczyń krwionośnych. Są one jednak mocno

nieuorganizowane, ich wyściółka endotelialna jest niekom-

pletna, często mają też „ślepe” końce. Prowadzi to do spo-

wolnionego przepływu krwi i nieefektywnego dostarczania

składników odżywczych oraz tlenu do komórek guzów no-

wotworowych. W efekcie w obrębie guza powstają regiony

hipoksji i anoksji, co promuje wzrost bakterii fakultatywnie

i obligatoryjnie beztlenowych. Jednocześnie występująca w

obrębie guzów nekroza dostarcza składników odżywczych

niezbędnych do wzrostu mikroorganizmów. Panujące w

guzach unikalne warunki określa się często mianem „sank-

tuarium immunologicznego”, jako że obserwuje się w nich

zjawisko restrykcji składników układu odpornościowego;

bezpośrednim skutkiem tego zjawiska jest zahamowanie me-

chanizmów usuwania bakterii. Opisane cechy tego mikrośro-

dowiska faworyzują więc selektywne namnażanie bakterii

anaerobowych. Obserwacje te spowodowały rozwój badań

nad zastosowaniem niektórych gatunków bakterii jako wek-

torów do dostarczania odpowiednich genów specyficznie do

tkanek nowotworowych (tzw. „tumor targeting”) [9, 10].

SALMONELLA SPP.

Jednymi z najdokładniej opisanych bakterii potencjalnie

użytecznych w terapii antynowotworowej są mikroorgani-

zmy rodzaju Salmonella, gramujemne względnie beztleno-

we, wewnątrzkomórkowe patogeny, które kolonizują guzy

człowieka i to zarówno te większe, jak i mniejsze, lepiej na-

tlenione. Szczep dziki S. enterica sv. Typhimurium powoduje

głównie zakażenia jelitowe, które nie leczone mogą wywoły-

wać ogólnoustrojowe infekcje. W celu odpowiedzi na pyta-

nie, jaki mechanizm jest odpowiedzialny za infekcje i wzrost

Salmonella w guzach po iniekcji dożylnej lub iniekcji do jamy

otrzewnej konieczne były badania nad rolą dwóch głównych

wysp patogenności zlokalizowanych na chromosomie S. ente-

rica sv. Typhimurium, SPI1 oraz SPI2. We wnętrzu guza znaj-

dują się leukocyty infiltrujące — makrofagi, komórki dendry-

tyczne, limfocyty i neutrofile o właściwościach antybakteryj-

nych. Zdolność bakterii Salmonella do pokonania tych barier

i przeżycia jest nieodzowna w jej zastosowaniu jako wektora

antyrakowego. W obrębie SPI1 Salmonella enterica sv. Typhi-

murium znajdują się geny kodujące białka budujące system

sekrecyjny typu III, który odgrywa kluczową rolę w proce-

sach inwazyjności (np. wnikanie do enterocytów). Geny SPI2

warunkują przeżycie bakterii we wnętrzu makrofagów i ko-

mórek epitelialnych. Aktywność genów SPI2 jest niezbędna

dla wywołania antynowotworowego efektu przez S. enterica

sv. Typhimurium poprzez warunkowanie namnażania bak-

terii w komórkach guza. Mutanty w genach SPI1 charakte-

ryzują się znacząco zredukowaną zdolnością do inwazji, nie

wpływa to jednak na indukowany efekt antynowotworowy

[9]. Pomimo poznania roli SPI2 w procesie tropizmu w sto-

sunku do komórek nowotworowych, mechanizm działania

antynowotworowego produktów genów kodowanych w ob-

rębie tej wyspy patogenności pozostaje nadal niewyjaśniony

i wymaga dalszych badań.

Zdolność bakterii z rodzaju Salmonella do wewnątrzko-

mórkowej inwazji i proliferacji w obrębie guzów potwier-

dzona została w badaniach z wykorzystaniem bakterii pro-

dukujących białko GFP (ang. Green Fluorescent Protein, zie-

lone białko fluoryzujące). Zarówno w badaniach in vitro, jak

i in vivo na modelu mysim, bakterie z rodzaju S. enterica sv.

Typhimurium, w których ekspresji ulegało GFP, były zdol-

ne do wzrostu i replikacji wewnątrz komórek nowotworo-

wych. Ponadto, po 6 dniach od dożylnej aplikacji szczepu

S. enterica sv. Typhimurium A1, liczba bakterii w zdrowych

tkankach zaczęła spadać, a po 15 dniach od iniekcji bakterie

lokalizowały się jedynie w obrębie guzów [12].

Ze względu na wysoką toksyczność związaną z zastoso-

waniem patogennego dla człowieka mikroorganizmu, stoso-

wanie bakterii rodzaju Salmonella w terapii antynowotworo-

wej wymagało konstrukcji atenuowanego szczepu. Za wyso-

ki poziom immunostymulacji odpowiedzialny jest głównie

LPS, składnik błony zewnętrznej bakterii, indukujący mię-

dzy innymi produkcję TNF-α. W celu obniżenia toksyczności

skonstruowano auksotroficzny szczep VNP20009 ze zmody-

fikowanym lipidem A. Szczep ten posiada delecje w genach

msbB oraz purI. Produkt genu msbB jest niezbędny do termi-

nalnej mirystylacji lipidu A, natomiast delecja purI wywołuje

konieczność dostarczenia zewnętrznego źródła adeniny. Mu-

tanty te, badane na modelu mysim, w znacznie mniejszym

stopniu indukowały produkcję TNF-α gospodarza, co skut-

kowało obniżeniem toksyczności przy jednoczesnym zacho-

waniu specyficzności wobec komórek nowotworowych oraz

opóźniało wzrost guza. Kolejne badania z zastosowaniem

atenuowanego szczepu S. enterica waaN (uprzednio: msbB)

oraz purI potwierdziły obniżoną patogenność oraz podwyż-

szoną zdolność do kolonizacji obszarów nowotworowych ze

względu na podwyższony w tych regionach poziom adeniny

[13,14]. Tak więc szczep VNP20009 powinien być odpowied-

nim kandydatem do konstrukcji bezpiecznych wektorów o

potencjalnym zastosowaniu w terapii antynowotworowej.

Niemniej jednak, w trakcie pierwszej fazy testów klinicznych

u pacjentów z przerzutowym czerniakiem oraz z przerzu-

towym rakiem nerkowokomórkowym nie potwierdzono

jego właściwości terapeutycznych. U żadnego z pacjentów

nie zaobserwowano regresji choroby nowotworowej po do-

żylnym podaniu szczepu VNP20009, a jedynie u trzech pa-

cjentów guzy były kolonizowane przez komórki Salmonella

[15]. Przyczyny tego zjawiska nie są znane. Dane z ostatnio

przeprowadzonych doświadczeń z wykorzystaniem szczepu

VNP20009 na modelu mysim wykazały zależność jego sku-

teczności od drogi podania preparatu. Po doustnej aplikacji

znacząca liczba podanych bakterii lokalizowała się w rejonie

guzów, skutkując spowolnieniem wzrostu guza oraz zwięk-

szoną przeżywalnością zwierząt. Jednoczesne podanie bak-

terii i cyklofosfamidu zwiększyło terapeutyczny efekt che-

mioterapii silnie indukując apoptozę komórek nowotworo-

wych bez istotnej toksyczności dla całego organizmu [16]. W

fazie doświadczeń są inne auksotroficzne szczepy S. enterica,

które także charakteryzują się preferencyjną kolonizacją no-

wotworów np. szczep A1, auksotrof wymagający do wzrostu

316

www.postepybiochemii.pl

leucyny i argininy [12,17]. Bakterie rodzaju Salmonella stoso-

wano również w połączeniu z konwencjonalnymi metodami

terapii antynowotworowej, takimi jak chemio- czy radiotera-

pia, w wyniku czego nastąpiło podwyższenie skuteczności

tych metod w badaniach na myszach [9,17,18].

CLOSTRIDIUM SPP.

Innymi mikroorganizmami o potencjalnym zastosowaniu

w terapii antynowotworowej są gramdodatnie, beztlenowe

wytwarzające spory, bakterie rodzaju Clostridium. Wiele, z

około 80 gatunków tego rodzaju, było testowanych pod ką-

tem potencjalnego zastosowania w terapiach antynowotworo-

wych. Pierwsze odnotowane przez Vautier’a przypadki wyle-

czenia raka powiązane z infekcją bakteryjną miały miejsce już

w 1813 roku na skutek przebycia zgorzeli gazowej. Ponad 130

lat później, w 1947 roku, po raz pierwszy zaobserwowano on-

kolizę i regresję mięsaka u myszy po iniekcji spor Clostridium

histolyticum do guza. Zmniejszeniu masy nowotworowej towa-

rzyszyła jednak silna toksyczność dla organizmu, powodująca

śmierć większości zwierząt. Również zastosowanie w podob-

nych doświadczeniach spor patogennego mikroorganizmu C.

tetani wywoływało śmierć zwierząt związaną z wysoką tok-

sycznością. Badania nad niepatogennymi fakultatywnymi

tlenowcami Bacillus subtilis i Bacillus mesentericus wykazały, że

nie wszystkie sporujące bakterie zdolne do wzrostu w warun-

kach beztlenowych wykazują podobny efekt antynowotworo-

wy, jako że spory Bacillus przygotowane w ten sam sposób,

nie indukowały procesu onkolizy. Na podstawie tych badań

sformułowano hipotezę, że chociaż u podstawy zastosowania

bakterii rodzaju Clostridium w terapii antynowotworowej leży

zdolność mikroorganizmów do namnażania w warunkach

beztlenowych, istotne są również inne, nie do końca scharakte-

ryzowane czynniki. W terapiach antynowotworowych mogły-

by potencjalnie znaleźć zastosowanie również zmodyfikowa-

ne genetycznie niepatogenne gatunki rodzaju Clostridium takie

jak np. C. sporogenes, C. acetobutylicum, C. oncolyticum czy C.

novyi [4]. Wykazano istotne różnice w skuteczności działania

spor zależnie od użytego w doświadczeniach gatunku. Z prze-

badanych przez Vogelstein i wsp. 26 gatunków anaerobowych

bakterii najwyższym poziomem kolonizacji guzów nowotwo-

rowych charakteryzował się gatunek C. novyi [19]. Ze wzglę-

du na wysoką toksyczność dzikiego szczepu, skonstruowano

atenuowany szczep C. novyi-NT pozbawiony genu kodujące-

go toksynę. Jednak efekty terapeutyczne odnotowano tylko w

połączeniu z chemioterapią [19,20]. Ostatecznie kombinowana

terapia w postaci aplikacji szczepu C. novyi-NT z chemiotera-

peutykami oddziałującymi na mikrotubule okazała się obiecu-

jąca i znajduje się obecnie w trakcie I fazy badań klinicznych

[21]. Podobne doświadczenia wykonane z użyciem innych

gatunków rodzaju Clostridium także udokumentowały celo-

wość stosowania terapii łączonych. Niestety niektóre z prze-

badanych strategii pomimo powodowania regresji guzów

prowadziły do śmierci zwierząt doświadczalnych [19, 20]. Po-

nadto, nie zawsze wyniki uzyskane podczas doświadczeń na

modelach mysich pokrywały się z tymi otrzymanymi podczas

badań klinicznych [4,5]. Ponieważ bakterie rodzaju Clostridium

są obligatoryjnymi beztlenowcami spory posiadają zdolność

do kiełkowania wyłącznie w guzach o odpowiednio dużych

rozmiarach, gwarantujących dogodne dla tej bakterii warunki

anoksji; mniejsze guzy są stosunkowo dobrze napowietrzone

i odżywiane. Również zewnętrzne warstwy litych guzów po

onkolitycznych terapiach pozostawały często nienaruszone, co

w konsekwencji prowadziło do rozwoju nowotworu. Ta ob-

serwacja także uzasadnia konieczność łączenia różnych strate-

gii terapeutycznych.

BIFIDOBACTERIUM SPP.

Opisane dotychczas dwa rodzaje mikroorganizmów: Sal-

monella i Clostridium są patogenami człowieka, ich zastoso-

wanie wiąże się więc z koniecznością konstrukcji szczepów

atenuowanych, ale nadal zachowujących tropizm wobec ko-

mórek nowotworowych. Problem ten nie dotyczy bakterii ro-

dzaju Bifidobacterium, gramdodatniego, niesporującego beztle-

nowego mikroorganizmu naturalnie występującego w prze-

wodzie pokarmowym człowieka i innych ssaków. Zaliczany

jest on do probiotyków oraz do grupy bakterii GRAS (ang.

Generalny Regarded As Safe), jednocześnie wykazując zdolność

do kolonizacji guzów nowotworowych, co czyni ten mikro-

organizm potencjalnie bezpieczniejszym wektorem w terapii

antyrakowej. Aby zbadać faktyczne powinowactwo bakterii

do guzów nowotworowych, liofilizat Bifidobacterium wstrzyk-

nięto myszom z rakiem Ehrlicha (rak jelita grubego i odbytu) i

badano przeżywalność oraz proliferację bakterii, wstrzykując

dootrzewnowo laktulozę, cukrowy substrat metabolizowany

przez ten mikroorganizm, ale nie przez komórki ssaków. Do-

żylne podanie laktulozy zwiększyło tempo wzrostu i poziom

przeżywalności bakterii, których znacząca liczba lokalizowa-

na była w obrębie guza, potwierdzając w ten sposób zdolność

Bifidobacterium do preferencyjnego kolonizowania guzów. Po-

nieważ zastosowanie Bifidobacterium nie przyniosło spodzie-

wanych efektów antynowotworowych, w przeciwieństwie do

opisanych uprzednio onkolitycznych właściwości związanych

z podaniem bakterii z rodzaju Salmonella oraz Clostridium, ko-

lejne badania skupiły się na ocenie potencjalnego zastosowa-

nia Bifidobacterium do dostarczania odpowiednich genów efek-

torowych do guzów. W tym celu Yazawa i wsp. sklonowali na

plazmidzie gen warunkujący oporność na spektynomycynę.

Transformowane nim bakterie B. longum wprowadzono do

mysich komórek czerniaka (B16-F10) oraz raka płuc Lewis´a.

Kolonie bakteryjne oporne na spektynomycynę wyizolowano

jedynie z komórek rakowych, co udokumentowało że bakte-

rie są zdolne do dostarczenia kodowanych na plazmidzie ge-

nów efektorowych i potencjalnie mogą znaleźć zastosowanie

w terapii antynowotworowej [22]. Trzeba jednak podkreślić,

że poziom kolonizacji guzów przez mikroorganizmy rodzaju

Bifidobacterium jest niższy niż ten udokumentowany dla mi-

kroorganizmów rodzaju Salmonella i Clostridium. Dodatkowo

zauważono, że mikroorganizmy rodzaju Bifidobacterium nie

rozprzestrzeniają się intensywnie w obrębie guza, co może

ograniczać zakres działania genu efektorowego. Ponadto, bak-

terie z rodzaju Bifidobacterium nie wytwarzają spor, co czyni je

bardziej wrażliwymi na zmienne warunki, a w związku z tym

nieco trudniejsze w hodowli i przechowywaniu [4].

ZASTOSOWANIE BAKTERII JAKO WEKTORÓW

DOSTARCZAJĄCYCH GENY CYTOTOKSYCZNE

Zastosowanie bakterii z rodzaju Bifidobacterium, Clostri-

dium i Salmonella jako żywego wektora do dostarczania

genów bezpośrednio indukujących śmierć komórek nowo-

tworowych polega na wprowadzeniu genów należących do

dwóch głównych kategorii, genów pro-apoptotycznych lub

Postępy Biochemii 58 (3) 2012

317

tzw. genów samobójczych (ang. suicide genes). Badanych i

opisanych przykładów wykorzystania bakterii w terapiach

samobójczych jest wiele, opierają się one jednak na podob-

nym schemacie tzw. systemie prolek — enzym. Zdecydo-

waną większość badań wykonano z użyciem atenuowanego

szczepu S. enterica VNP20009 lub jego pochodnych stosowa-

nych jako nośniki odpowiednich genów. Szczep VNP20009

wykazuje wysoką zdolność do kolonizacji guzów przy jed-

noczesnej stosunkowo niskiej toksyczności. Po raz pierwszy

antynowotworowe właściwości tego szczepu udokumento-

wali w 1997 roku Pawelek i wsp., rozpoczynając serię badań

z wykorzystaniem rożnych genów efektorowych i różnych

pochodnych tego szczepu [13,23].

Chociaż bakterie nie mogą przeprowadzać niektórych

ssaczych potranslacyjnych modyfikacji białek, jest wiele pro-

tein efektorowych, które nie wymagają takich modyfikacji i

potencjalnie mogą być skuteczne w genowych terapiach an-

tynowotworowych. Należy do nich np. kinaza tymidynowa

wirusa opryszczki (HSV-TK). Dostarczenie przez S. enterica

sv. Typhimurium plazmidu z genem kodującym HSV-TK

wraz z aplikacją proleku gancyklowiru, analogu nukleozy-

dów, aktywowanego przez ten enzym, prowadziło do znacz-

nego zmniejszenia rozmiaru guzów. Spowodowane było to

aktywacją proleku do jego chemioterapeutycznej formy po-

przez enzym kodowany przez gen dostarczony na wektorze

bakteryjnym [24]. Innym przykładem o podobnym mechani-

zmie była konstrukcja plazmidu zawierającego gen kodują-

cy ePNP (fosforylaza nukleozydów purynowych Escherichia

coli) wyrażany z silnego promotora CMV (ang. cytomegalovi-

rus). Plazmidem tym stransformowano atenuowany szczep

S. enterica sv. Typhimurium i przebadano efekt jego aplikacji

wraz z MePdR (2-deoksyryboza 6-metylopurynowa). Enzym

ePNP powodował konwersję nietoksycznego proleku w wy-

soce toksyczną 6-metylopurynę (6-MeP) [25]. MeP ma wła-

ściwości cytotoksyczne i antyproliferacyjne, co prowadzi do

śmierci komórek w wyniku ich spontanicznej apoptozy. W

doświadczeniach in vivo, przeprowadzonych na myszach z

rakiem trzustki, obserwowano znaczącą regresję guza, nawet

w przypadku guzów dużych rozmiarów, w wielu przypad-

kach prowadzącą nawet do całkowitego zaniku guza. Dzia-

łaniu temu towarzyszyły jednak silne efekty uboczne. Dalsze

badania i ewentualne ulepszanie tego systemu daje jednak

duże szanse opracowania skutecznej terapii dla pacjentów z

rakiem trzustki, którego leczenie jak do tej pory jest bardzo

mało skuteczne [26]. System ePNP/MePdR w wielu ekspery-

mentach stanowił efektywną strategię typu gen samobójczy/

prolek. Udokumentowano znaczącą jego antyrakową aktyw-

ność w przypadku raka jajnika, glejaka, czerniaka, raka pro-

staty, trzustki, wątroby i pęcherza. W kolejnych badaniach

stosowano również system ePNP/MoPdR (2′-deoksyryboza

6-metoksypurynowa), w wyniku działania którego zamiast

metylopuryny powstaje metoksypuryna, indukująca rów-

nież spontaniczną apoptozę komórek [25]. Jest możliwe, że

jednoczesna obecność komórek ulegających apoptozie, bak-

teryjnych produktów jak np. lipopolisacharydy oraz bakte-

ryjnego DNA, mogłaby działać jako sygnał o niebezpieczeń-

stwie dla infiltrujących komórek układu odpornościowego.

Lokalna obfitość tych sygnałów, związana z fagocytozą

martwych komórek rakowych przez makrofagi, ze sporym

prawdopodobieństwem jest zdolna zainicjować odpowiedź

immunologiczną wobec specyficznych rakowych antygenów

i zwiększyć spontaniczną apoptozę komórek guza.

W celu zwiększenia efektu terapeutycznego szczepu

VNP20009, skonstruowano jego pochodną, szczep TAPET-CD

niosący gen E. coli kodujący deaminazę cytozyny (CD), en-

zym warunkujący konwersję nietoksycznej 5-fluorocytozyny

(5-FC) w 5-fluorouracyl (5-FU), fluorową pochodną uracylu,

mającą działanie cytostatyczne. Działanie antynowotworo-

we 5-FU polega na inhibicji syntazy tymidylanowej, enzymu

odpowiedzialnego za biosyntezę monofosforanu tymidyny

(TMP). Niski poziom TMP powoduje zakłócenia replikacji

DNA oraz zahamowanie proliferacji komórek rakowych [27].

Po pozytywnych wynikach otrzymanych na modelu mysim,

we wstępnych badaniach klinicznych z wykorzystaniem TA-

PET-CD, trzem pacjentom zaaplikowano badany preparat bez-

pośrednio do guza po czym podano im 5-FC. Pomimo zaob-

serwowania u dwu pacjentów kolonizacji guza przez mikroor-

ganizmy przez okres 15 dni oraz przekształcenia 5-FC w 5-FU

ta strategia nie wykazała znaczących efektów terapeutycznych

[28]. Natomiast obiecujące wyniki otrzymano w badaniach

z zastosowaniem pochodnej szczepu VNP20009 niosącej gen

kodujący karboksypeptydazę G2 (CG2), gdy rekombinowane

bakterie dostarczane były wraz z prolekiem. CG2 katalizuje

przekształcenie zastosowanego proleku w silnie reaktywne

związki alkilujące, które penetrują do wnętrza komórki uszka-

dzając DNA i powodując śmierć komórek nowotworowych,

nie wpływając ujemnie na wzrost bakterii i ich dalsze powie-

lanie. Zarówno w badaniach in vitro z użyciem ludzkich linii

nowotworowych, jak i in vivo na modelu mysim odnotowano

znaczny efekt onkolityczny i redukcję wzrostu guza [29].

Aby zapewnić lepszą kontrolę oraz dodatkowo zwiększyć

antyrakowe właściwości wprowadzanych genów, rozpoczęto

badania nad systemem regulacji ich ekspresji. W doświadcze-

niach dotyczących „wewnątrzguzowej” indukcji genów użyto

dwóch systemów promotor/gen reporterowy. W pierwszym

z nich zastosowano komórki rodzaju Salmonella niosące gen

lucyferazy wyrażany z promotora wrażliwego na tetracykli-

nę [30]. Po dożylnym podaniu myszom anhydrotetracykliny

obserwowano produkcję lucyferazy w komórkach nowo-

tworu, gdzie preferencyjnie lokalizowały się bakterie niosące

plazmid z genem reporterowym [9]. W drugim z badanych

systemów sklonowany w komórkach Salmonella gen kodujący

kolicynę E3 znajdował się pod kontrolą promotora zależnego

od sygnałów naprawy DNA, SOS. Kolicyna E3 hamuje pro-

liferację komórek nowotworowych; natomiast zastosowany

promotor warunkuje ekspresję kontrolowanych przez niego

genów w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. W tych doświad-

czeniach obserwowano produkcję kolicyny wewnątrz guza po

dootrzewnowej iniekcji mitomycyny C lub po potraktowaniu

promieniowaniem X powodującym uszkodzenia DNA i in-

dukcję ekspresji z promotora wrażliwego na SOS. Dodatkowe

badania dotyczące mutantów recN wykazały ich zwiększoną

wrażliwość na indukcję produkcji wewnątrz guza kolicyny

eksprymowanej pod kontrolą analizowanego promotora [9].

Zastosowanie indukowalnych promotorów umożliwiłoby

precyzyjną kontrolę ekspresji genów o właściwościach anty-

nowotworowych pozwalając np. na „włączenie“ ekspresji w

momencie, gdy znacząca liczba bakterii dotarłaby już do guza,

wywołując silniejszy efekt przy minimalizacji działania genu

efektorowego poza obszarem nowotworu.

318

www.postepybiochemii.pl

Przykładem zastosowania bakterii do indukcji specyficz-

nej dla nowotworu apoptozy pod kontrolą indukowalnego

promotora jest wykorzystanie szczepu Salmonella VNP20009

eksprymującego TRAIL pod kontrolą prokariotycznego pro-

motora genu recA. Zewnątrzkomórkowa domena związanego

z TNF ligandu indukującego apoptozę (TRAIL) jest silnym

induktorem apoptozy w komórkach nowotworowych, o mi-

nimalnej toksyczności wobec komórek zdrowych. Promotor

genu recA prokariotów uczestniczy w odpowiedzi SOS „włą-

czanej” w wyniku uszkodzeń DNA. Zaindukowana promie-

niowaniem gamma ekspresja genu kodującego TRAIL z pro-

motora recA z wprowadzonego przez szczep VNP20009 wek-

tora wywołała redukcję guzów u myszy [31]. Podobne wyniki

otrzymano z zastosowaniem B. longum [32].

Od niedawna rozwój inżynierii genetycznej umożliwił kon-

struowanie rekombinowanych szczepów bakterii rodzaju Clo-

stridium. Jeden z głównych systemów prolek/enzym opiera-

jący się na zastosowaniu Clostridium spp. jako wektora wyko-

rzystuje deaminazę cytozynową (CD) E. coli. Gen kodujący CD

sklonowano na wektorze Clostridium beijerincki pod kontrolą

silnego promotora, uzyskując wysoki poziom ekspresji genu

kodującego ten enzym w komórkach rakowych, co prowadzi-

ło do uszkodzeń DNA i RNA w wyniku aktywacji 5-FU. Inną

strategią wykorzystującą jako wektor Clostridium beijerinckii

jest system nitroreduktaza/CB1954 — nitroreduktaza (NTR)

E. coli. NTR metabolizuje CB1954 (5-azyrydynylo-2,4-dinitro-

benzamid) w silnie alkilujący czynnik prowadzący do powsta-

nia „cross-links” w DNA, co doprowadza do śmierci komór-

ki. Chociaż badane układy ekspresyjne wykazały aktywność

obu systemów in vitro, to efekt terapeutyczny w badaniach na

zwierzętach nie był wystarczający. Było to prawdopodobnie

spowodowane niskim poziomem kolonizacji guzów in vivo. W

początkowych badaniach stosowano szczepy sacharolitycz-

ne, które kolonizują guzy z częstością 1000 krotnie niższą niż

szczepy proteolityczne [4]. W 2006 roku opracowano metody-

kę manipulacji materiałem genetycznym szczepów proteoli-

tycznych takich jak np. C. novyi-NT, którego możliwość zasto-

sowania w terapiach antynowotworowych jest w trakcie ba-

dań klinicznych [21,33]. Analogicznie do opisanych powyżej

doświadczeń z zastosowaniem 5-FC lub NTR, znacznie lepszy

efekt antynowotworowy uzyskano w przypadku szczepów

proteolitycznych w porównaniu do uprzednio stosowanych

szczepów sacharolitycznych [4].

Podobne badania, choć nie tak intensywne jak w od-

niesieniu do Salmonella i Clostridium były prowadzone z

użyciem mikroorganizmów rodzaju Bifidobacterium. Skon-

struowano szczepy B. longum i B. breve eksprymujące de-

aminazę cytozyny CD. Dożylne wstrzyknięcie tych bakterii

wraz z jednoczesnym podaniem proleku 5-FC skutkowało

aktywacją proleku do jego aktywnej formy w rejonach guza

[34,35]. Opisana już powyżej na przykładzie Salmonella te-

rapia z użyciem kinazy tymidynowej wirusa opryszczki

(HSV-TK) w połączeniu z aplikacją gancyklowiru (HSV-

-TK/GCV) okazała się również efektywna w przypadku

użycia Bifidobacterium infantis jako żywego wektora. Bakte-

rie niosące gen kodujący kinazę tymidynową wstrzyknięto

szczurom z nowotworem pęcherza moczowego, podając

jednocześnie gancyklowir. Skutkiem tego było zahamowa-

nie wzrostu guza oraz apoptoza komórek nowotworowych,

prawdopodobnie w wyniku zwiększonej ekspresji genu ko-

dującego kaspazę 3 [34].

ZASTOSOWANIE MIKROORGANIZMÓW

W CELU MODULACJI ANTYNOWOTWOROWEJ

AKTYWNOŚCI UKŁADU ODPORNOŚCIOWEGO

Układ odpornościowy ma za zadanie ochronę organizmu

przed chorobami, identyfikację i likwidację czynników in-

fekcyjnych oraz komórek nowotworowych. W celu jego

prawidłowego działania niezbędne jest rozróżnienie między

patogenami bądź tkankami nowotworowymi a zdrowymi

komórkami i tkankami. Cechą charakterystyczną systemu

odpornościowego jest tolerancja dla protein niskoimmu-

nogennych, do których należą m.in. białka nowotworowe.

Dlatego też jednym z głównych celów w terapii antyrakowej

jest złamanie tej tolerancji i podwyższenie poziomu odpow-

iedzi odpornościowej wobec komórek nowotworowych.

Obiecujące wyniki uzyskano wykorzystując do tego celu

bakterie jako nośniki szczepionek DNA.

Szczepionki DNA to bakteryjne plazmidy, które zostały tak

skonstruowane, aby specyficzny antygen ulegał ekspresj pod

kontrolą eukariotycznego promotora, co pozwala na ekspre-

sję heterologicznych genów w komórkach ssaczych. Plazmid

stosowany jako szczepionka DNA zawiera ponadto termi-

nator warunkujący zakończenie transkrypcji genu, obszary

DNA warunkujące replikację plazmidu oraz marker selekcyj-

ny ułatwiający produkcję plazmidów w transformowanych

bakteriach. Poza kodowaniem jednego lub kilku antygenów,

szczepionki te mogą również zawierać geny, których pro-

dukty charakteryzują się działaniem immunostymulacyjnym

bądź immunomodulacyjnym. Szczepionki DNA podawane są

m.in. domięśniowo lub podskórnie, bądź też obcy plazmido-

wy DNA może być dostarczany do organizmu uodparniane-

go przez odpowiednie szczepy bakteryjne. Kodowany na pla-

zmidzie antygen jest produkowany w komórkach gospodarza

głównie w profesjonalnych komórkach prezentujących anty-

gen (APCs), co prowadzi do stymulacji odpowiedzi odporno-

ściowej, przede wszystkim do pobudzenia naiwnych limfocy-

tów T CD8+ poprzez prezentację antygenu eksprymowanego

wewnątrz komórki przy udziale MHC klasy I. Rozpoznanie

to prowadzi do pobudzenia funkcji efektorowych limfocytów

T CD8+, a w konsekwencji do produkcji cytotoksycznych czą-

steczek w celu lizy eksprymujących dany antygen komórek,

jak również do stymulacji sekrecji cytokin, które wpływają na

poziom transkrypcji wielu genów w docelowych komórkach

oraz rekrutują inne komórki układu odpornościowego. Biorą

one także udział w procesie apoptozy poprzez oddziaływanie

Fas-Fas ligand [36-38]. Dodatkowo, jako że wykorzystywane

bakteryjne plazmidy DNA zawierają niemetylowane motywy

CpG podanie tego typu preparatu prowadzi do stymulacji

wrodzonego układu odpornościowego poprzez interakcję z

receptorami TLR 9 (ang. Toll-like receptor 9) [36,39].

W ostatnich latach badania dotyczące zastosowania szcze-

pionek DNA w walce z rakiem nabrały nowego wymiaru

ponieważ dowiedziono, że wiele komórek nowotworowych

koduje tzw.

antygeny związane z nowotworem (TAA, ang.

tumor associated antigens), zdolne do indukcji długotrwałej od-

porności. Do tej pory zidentyfikowanych zostało już wiele spe-

cyficznych dla ludzkich nowotworów antygenów, będących

Postępy Biochemii 58 (3) 2012

319

celem działania dla limfocytów T CD8+. Pierwszym z nich był

antygen MAGE-1 (ang. Melanoma Antigen 1). Pośród zidentyfi-

kowanych antygenów jest wiele obiecujących kandydatów do

zastosowania jako cele w immunoterapii raka. Dostarczenie

szczepionek DNA kodujących nowotworowy antygen bądź

jego epitopy działało skutecznie w doświadczeniach wyko-

nywanych na modelach zwierzęcych i dotyczących terapii

różnych rodzajów nowotworów, takich jak czerniak, nerwiak

płodowy i wielu gruczolakorakach. Efektywną ochronę zaob-

serwowano m.in. w przypadku fuzji epitopu gp100 (antygen

związany z czerniakiem) i TRP2 (ang. tyrosine-related protein-2)

z ubikwityną; połączeniu epitopu hydroksylazy tyrozynowej

z ubikwityną czy też immunizacji przy użyciu antygenu PSA

(ang. prostate-specific antygen) [3,38].

Badania przeprowadzone na modelu mysim z implantowa-

nymi guzami dostarczyły przekonywujących dowodów do-

kumentujących zdolność limfocytów T CD8+ do odrzucenia

nowotworu. Ponadto, udowodniono, że otrzymanie in vitro

autologicznych, specyficznych wobec antygenu/ów komórek

nowotworowych limfocytów T CD8+, a następnie podanie ich

pacjentom, w wielu przypadkach prowadziło do regresji guza.

Jednak wiele badań, przeprowadzonych m.in. przez Conry-

’ego i wsp. pokazało, że domięśniowe bądź podskórne poda-

nie „nagich” plazmidowych szczepionek wywoływało jedy-

nie słabą odpowiedź u pacjentów z chorobą nowotworową

[40,41]. Konieczne stało się wiec poszukiwanie sposobów po-

wodujących zwiększenie immunogenności tych szczepionek.

Dwie główne strategie stosowane w tym celu obejmują mo-

dyfikację sposobu podania preparatu (zastosowanie szczepów

bakteryjnych jako nośników) oraz zastosowanie adiuwantów,

substancji modulujących odpowiedź immunologiczną lub

wręcz pozwalających na jej wywołanie. Dzięki zastosowaniu

tych preparatów odpowiedź odpornościowa może zostać za-

indukowana nawet wobec antygenów, które normalnie nie

są „zauważane” przez układ odpornościowy. Niewątpliwą

zaletą szczepionek zawierających plazmidowy DNA jest ich

stosunkowa łatwość wytwarzania oraz potwierdzone w wielu

badaniach bezpieczeństwo. Obecnie wiele z tych produktów

znajduje się w później fazie testów klinicznych [1,42-44].

LBV — ATENUOWANE BAKTERIE JAKO

WEKTORY SZCZEPIONEK DNA W GENOWEJ

TERAPII ANTYNOWOTWOROWEJ

Najbardziej obiecującym sposobem wprowadzenia pla-

zmidów eksprymujących eukariotyczny antygen (szczepionki

DNA) w celu indukcji skutecznej odpowiedzi immunologicz-

nej wobec komórek nowotworowych jest użycie szczepionek

wykorzystujących atenuowane wewnątrzkomórkowe bakte-

rie jako żywe wektory do ich dostarczenia. Mikroorganizmy

stosowane są zarówno do dostarczania specyficznych dla no-

wotworu antygenów, antygenów blokujących procesy angio-

genezy, jak również jako nośniki dostarczające substancje mo-

dulujące układ odpornościowy, głównie interleukinę 2. Od-

powiedź generowana przez LBV (ang. attenuated live bacterial

vaccine) skierowana jest nie tylko przeciwko heterologicznemu

antygenowi, ale także przeciwko antygenom użytego jako no-

śnik patogenu. Wykorzystanie niektórych mikroorganizmów

umożliwia dostarczenie antygenu poprzez powierzchnię ślu-

zówki jelit do komórek APCs. Stosowane są w tym celu szcze-

py atenuowanych zarówno gramdodatnich, jak i gramujem-

nych mikroorganizmów. W badaniach in vitro potwierdzono

zdolność tych bakterii do dostarczania szczepionek DNA do

komórek ludzkich, a in vivo skuteczność tego procesu zwery-

fikowano w doświadczeniach wykonanych na modelach my-

sich z różnymi rodzajami nowotworów. Od lat prowadzone

są testy kliniczne mające na celu ocenę bezpieczeństwa, sku-

teczności oraz immunogenności wybranych szczepów bakte-

ryjnych. Strategia LBV

wykorzystuje drogę administracji imi-

tującą naturalną infekcję patogenem, co może prowadzić do

długotrwałej humoralnej i komórkowej odpowiedzi zarówno

lokalnej w obrębie śluzówki, jak i ogólnoustrojowej. Ponadto,

podanie preparatu tą drogą powoduje mniej efektów ubocz-

nych, a w wielu przypadkach jest też tańsze [38].

Najczęściej stosowane w badaniach szczepy wykorzysty-

wane jako żywe wektory to atenuowane mutanty Salmonella

enterica sv. Typhimurium i sv. Typhi. S. enterica sv. Typhi jest

zdolna do przeżycia i replikacji we wnętrzu wakuoli komórek

APCs, takich jak komórki dendrytyczne i makrofagi. Szczep

Ty21a (atenuowany mutant S. enterica sv. Typhi Ty2) stoso-

wany jest jako szczepionka przeciwko durowi brzusznemu.

Szczep ten otrzymano w wyniku mutagenezy chemicznej,

prowadzącej do powstania wielu nieodwracalnych mutacji,

skutkujących m.in. wrażliwością na galaktozę (mutacja w ge-

nie galE), auksotrofią pod względem izoleucyny i waliny (gen

ilvD), brakiem otoczki polisacharydowej (gen via) i redukcją

oporności na stres (gen rpoS). Nie odnotowano rewersji ko-

mórek do typu dzikiego ani w warunkach in vitro ani in vivo,

otrzymany szczep jest genetycznie stabilny [45, 46]. Problemem

związanym z zastosowaniem S. enterica Ty21a jest konieczność

aplikacji wielu dawek w celu wywołania odpowiedzi o cha-

rakterze ochronnym. Dlatego też prowadzone doświadczenia

mają na celu konstrukcję szczepu zdolnego do wywołania

skutecznej odporności po zastosowaniu pojedynczej doustnej

immunizacji. Wśród intensywnie badanych wymienić należy

szczep CVD908, posiadający delecje w genach aroC i aroD (wy-

wołuje to auksotrofię w stosunku do aminokwasów aroma-

tycznych) oraz szczep CVD908-htrA

-

z usuniętym dodatkowo

genem htrA, kodującym peryplazmatyczną proteazę seryno-

wą odpowiedzialną za degradację nieprawidłowo zwiniętych

białek powstających w warunkach stresowych. Mutacja ta

upośledza więc odpowiedź bakterii m.in na stres oksydacyj-

ny, a w związku z tym, także zdolność do przeżycia wewnątrz

makrofagów. Mutacje w genach aroC i aroD limitują wzrost

bakterii, jako że w ssaczych tkankach wymagane aromatyczne

substraty znajdują się w niewystarczających do normalnego

wzrostu ilościach. Oba atenuowane szczepy S. enterica Ty21a

okazały się silnie immunogenne już po doustnym podaniu

jednej dawki. Szczep CVD908, pomimo że był dobrze tolero-

wany, przedostawał się do krwiobiegu pacjentów po podaniu

stosunkowo dużej dawki, dlatego też jego dalsze wykorzysta-

nie w terapii okazało się niemożliwe. W przeciwieństwie do

CVD908, nie odnotowano obecności szczepu CVD908-htrA w

krwiobiegu, dlatego uważany jest on za bezpieczny [44,47].

Innym szczepem S. enterica sv. Typhi badanym pod wzglę-

dem użyteczności w zastosowaniu jako LBV jest m.in. ZH9

posiadający mutacje w genach aroC i ssvA (gen kodujący pro-

teinę biorącą udział w sekrecji białek w systemie sekrecyjnym

typu III SPI2). Szczep ten jest silnie immunogenny, a zarazem

bezpieczny w fazie II testów klinicznych; jego aplikacja skut-

kowała wywołaniem wysokiego poziomu odpowiedzi od-

320

www.postepybiochemii.pl

pornościowej humoralnej, komórkowej i związanej z błonami

śluzowymi [48]. Innym przykładem jest pochodzący od Ty2

szczep Ty800, posiadający dodatkowo delecje w genach ukła-

du dwuskładnikowego phoP-phoQ, odpowiedzialnym za kon-

trolę przeżycia bakterii w fagosomie. W badaniach klinicznych

w fazie I był dobrze tolerowany i silnie immunogenny [38].

W badaniach nad zastosowaniem mikroorganizmów jako

LBV wykorzystuje się również mutanty Shigella spp. oraz Li-

steria monocytogenes. Bakterie te po wydostaniu się z fagosomu

do cytoplazmy komórki gospodarza replikują się w niej, a na-

stępnie mogą się rozprzestrzeniać do sąsiadujących komórek.

Unikalna zdolność tych bakterii do przedostania się do cyto-

zolu czyni je potencjalnie idealnym wektorem do dostarczania

specyficznych antygenów do komórek APC. Eksprymowane

w cytoplazmie antygeny prezentowane są głównie z udzia-

łem MHC klasy I, jednocześnie znaczna część bakterii pozo-

staje uwięziona w fagosomie, a produkowane przez nie białka

prezentowane są na powierzchni komórki za pomocą MHC

klasy II, co skutkuje silniejszą odpowiedzią przeciwko anty-

genowi [49,50]. W badaniach przedklinicznych na małpach

zastosowanie pierwszych badanych mutantów Shigella, zawie-

rających jedynie mutacje w genach aro przyniosło obiecujące

wyniki, w badaniach na ochotnikach wyniki te były jednak

mniej przekonujące. Mutanty aro były zbyt słabo atenuowane

i niezbędne okazało się wprowadzenie dodatkowych mutacji

w celu zwiększenia bezpieczeństwa preparatu. Szczep Shigella

flexneri SC602, pozbawiony genu virG oraz iucA-iut, chromoso-

mowego locus zaangażowanego w proces syntezy sideroforu

(aerobaktyny) utracił zdolność do poruszania się wewnątrz

komórki, a także przedostawania się do sąsiednich komórek

nabłonka jelitowego. Pomimo zachęcających wyników otrzy-

manych w badaniach przedklinicznych, szczep ten okazał się

nieprzydatny w testach klinicznych. Inny otrzymany szczep

Shigella, szczep CVD1208, w pierwszej fazie badań klinicznych

był dobrze tolerowany przy jednoczesnej stosunkowo silnej

immunogenności. Posiada on mutację w operonie guaBA, cze-

go skutkiem jest defekt syntezy nukleotydów guaninowych.

Dodatkowo mutant ten pozbawiony jest genów kodujących

enterotoksyny 1 i 2, co podwyższa poziom jego bezpieczeń-

stwa w zastosowaniu jako LBV [38].

Jednym z ostatnio badanych szczepów L. monocytogenes był

podwójny mutant Lm z usuniętymi genami actA i plcB. Białko

ActA odpowiada za zdolność bakterii do ruchu wewnątrz ko-

mórki eukariotycznej i wraz z fosfolipazą C, kodowaną przez

plcB, uczestniczy w przemieszczaniu się bakterii do innych ko-

mórek. Fosfolipaza C bierze dodatkowo udział w lizie waku-

oli w komórce gospodarza. W badaniach na myszach szczep

Lm actA

-

plcB

-

okazał się bezpieczny, a jednocześnie jego po-

danie prowadziło do wywołania odpowiedzi immunologicz-

nej zależnej od cytotoksycznych limfocyów T (CD8+) [51]. U

ochotników, których w trakcie fazy I testów klinicznych im-

munizowano przy użyciu tego zmutowanego szczepu odno-

towano specyficzną wobec Listeria odpowiedź odpornościo-

wą. Jednocześnie u kilku pacjentów zaobserwowano jednak

zaburzenia w funkcjonowaniu wątroby, które związane mo-

gły być ze szczepieniem [52]. Niezbędne jest przeprowadzenie

dalszych badań w celu oszacowania przydatności tego szcze-

pu w terapiach. Innym potencjalnie interesującym szczepem

jest L. monocytogenes actA

-

inlB

-

z usuniętym genem kodującym

internalinę, białko ułatwiające wniknięcie bakterii do wnętrza

komórek niefagocytujących. Delecja w genie internaliny miała

więc na celu obniżenie toksyczności wobec komórek niefago-

cytujących, takich jak hepatocyty. Szczep ten w badaniach na

myszach okazał się bezpieczny, a zarazem immunogenny [53].

MIKROORGANIZMY JAKO NOŚNIKI SPECYFICZNYCH

DLA NOWOTWORU ANTYGENÓW ORAZ BIAŁEK

BLOKUJĄCYCH PROCESY ANGIOGENEZY

Szczepionki DNA mają na celu złamanie tolerancji na ni-

skoimmunogenne białka eksprymowane na powierzchni ko-

mórek nowotworowych. Odkrycie istnienia antygenów specy-

ficznych dla różnych rodzajów nowotworów wraz z postępem

w użyciu żywych bakterii jako nośników genów eukariotycz-

nych zapoczątkowało nową erę w badaniach nad leczeniem

nowotworów. Prowadzone w ostatnich latach doświadczenia

nad zastosowaniem bakterii jako wektorów do dostarcza-

nia antygenów specyficznych dla nowotworów przyniosły

obiecujące wyniki. Białko NY-ESO-1 często występuje na po-

wierzchni komórek nowotworowych, nie jest natomiast odnaj-

dywane na powierzchni normalnych komórek somatycznych.

Białko to jest silnie immunogennym antygenem, jednak w wie-

lu nowotworach jego obecność jest różna i w przypadku czer-

niaka, raka prostaty, płuc czy jajnika NY-ESO-1 eksprymowa-

ne jest w około 20–40% nowotworów. Rekombinowany szczep

S. enterica sv. Typhimurium produkujący NY-ESO-1 został

skonstruowany tak, aby umożliwić dostarczenie tego antyge-

nu do cytoplazmy APCs poprzez system sekrecji typu III. Po-

danie tak skonstruowanego szczepu myszom z nowotworem,

w którym NY-ESO-1 był syntetyzowany, wywoływało odpo-

wiedź odpornościową i regresję guza. W trakcie nowatorskich

badań skonstruowano rekombinowany szczep S. enterica sv.

Typhimurium SL3261, w którym nukleotydowe sekwencje

kodujące epitopy antygenu NY-ESO-1 wklonowane zostały w

nukleotydową sekwencję genu kodującego jedno z białek two-

rzących fimbrie. Fimbrie występują na powierzchni wielu pa-

togennych bakterii i posiadają zdolność do prezentowania ob-

cych antygenów. Doustne podanie rekombinowanego szcze-

pu SL3261 transgenicznym myszom wywoływało pobudzenie

specyficznej wobec eksprymowanego epitopu cytotoksycznej

odpowiedzi T-komórkowej [54]. Obiecujące wyniki otrzyma-

no też w przypadku zastosowania rekombinowanej S. enteri-

ca sv. Typhimurium eksprymującej różne antygeny: antygen

gp100 (antygen związany z czerniakiem) połączony z częścią

stałą łańcucha przeciwciała [38] antygen HPV16L1 związany

z nowotworem szyjki macicy [55] czy śródbłonkowy marker

nowotworowy TEM8 (ang. tumor endothelial marker 8) [49].

Pierwsze obiecujące badania nad użyciem żywych bakte-

rii Listeria monocytogenes do dostarczenia antygenów zwią-

zanych z nowotworami opublikowane zostały w latach

dziewięćdziesiątych, od tego czasu L. monocytogenes jest jed-

nym z najintensywniej badanych gatunków bakterii dostar-

czających antygeny związane z nowotworem. W ostatnich

latach skonstruowano wiele atenuowanych szczepów L.

monocytogenes eksprymujących takie antygeny jak HPV-16

E7, antygen związany z nowotworem szyjki macicy, głowy

oraz szyi, PSA (prostate specific antigen), antygen specy-

ficzny dla raka prostaty, związany z czerniakiem antygen

MAGE czy Her-2/neu, antygen nadeksprymowany w oko-

ło 30% przypadków raka piersi. W badaniach przedklinicz-

nych na modelu mysim szczepy te okazały się wysoce im-

Postępy Biochemii 58 (3) 2012

321

munogenne, a ich aplikacja powodowała regresję guza, w

którym dochodziło do ekspresji dostarczonego przez bak-

terie antygenu. W ostatnich latach rekombinowany szczep

Lm-HPV16 E7 (ADXS11-001) poddany został badaniom

klinicznym z udziałem pacjentek z zaawansowanym nowo-

tworem szyjki macicy. U 30% badanych pacjentek zaobser-

wowano redukcję rozmiaru guza, u dwóch z nich guzy zo-

stały całkowicie wyleczone [49]. Pomimo dość obiecujących

wyników, niezbędne jest przeprowadzenie dalszych badań

w celu oszacowania przydatności opisanych szczepów w

terapiach. Przewagą L. monocytogenes nad innymi gatunka-

mi bakterii stosowanymi jako wektor do dostarczania an-

tygenów specyficznych dla nowotworu jest unikalny cykl

życiowy tej bakterii oraz wynikający z tego fakt prezentacji

eksprymowanego przez Listeria antygenu zarówno przy

udziale MHC klasy I, jak i MHC klasy II, a także zdolność

do przemieszczania się bakterii do sąsiadujących komórek.

Cechy te związane są jednak z wysoką wirulencją tego pa-

togenu, stworzenie idealnego wektora wiąże się więc z uzy-

skaniem optymalnego balansu pomiędzy atenuacją a zacho-

waniem tych unikalnych cech jako wektora [56].

Proces wzrostu guza i powstawania przerzutów jest

silnie związany z procesami angiogenezy. Hamowanie

rozwoju naczyń zaopatrujących guz w tlen i składniki od-

żywcze może być doskonałą strategią walki z chorobami

nowotworowymi. W pionierskich badaniach nad zastoso-

waniem bakterii w tym celu, skonstruowano szczepionkę

z użyciem Salmonella niosącą na plazmidzie gen kodujący

FLK-1 (VEGFR2, ang. vascular endothelial growth factor recep-

tor 2, receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego)

bądź jedynie epitop/y tego receptora. Doustna aplikacja tej

szczepionki myszom prowadziła do stymulacji odpowiedzi

odpornościowej z udziałem limfocytów T CD8+ i prowadzi-

ła do supresji angiogenezy, uniemożliwiając w ten sposób

dopływ krwi do tkanki nowotworowej [57]. Doustne po-

danie Salmonella eksprymującej FLK-1 myszom z glejakiem

wywoływało zahamowanie wzrostu guza, redukcję naczyń

krwionośnych związanych z guzem oraz wydłużenie okre-

su życia zwierząt [58]. FLK-1 odgrywa istotną rolę w roz-

woju i progresji nowotworów płuc. Białko FLK-1 kodowane

jest przez gen o wielkości 4kb. Im dłuższy gen, tym większe

ryzyko pojawienia się mutacji. W celu zmniejszenia ryzy-

ka spontanicznych mutacji oraz uniknięcia pracy z dużym

białkiem w przeprowadzonych niedawno badaniach z za-

stosowaniem atenuowanego szczepu Salmonella SL3261 na

wektorze sklonowano jedynie fragment kodujący zewną-

trzkomórkową domenę FLK-1. Doustne podanie tego kon-

struktu myszom z nowotworem płuc Lewisa spowodowało

złamanie tolerancji odpornościowej wobec antygenu FLK-1,

skutkując zahamowaniem wzrostu guzów oraz zwiększo-

ną przeżywalnością zwierząt doświadczalnych [57]. Innym

przykładem terapii blokującej proces angiogenezy było do-

starczenie endogliny (CD105), transbłonowej glikoproteiny,

będącej receptorem transformującego czynnika wzrostu

(TGF)-β i ulegającej nadprodukcji w proliferujących komór-

kach endotelialnych nowo utworzonych naczyń krwiono-

śnych nowotworu piersi. Jako wektor użyty został atenu-

owany szczep S. enterica sv. Typhimurium niosący mutację

w genach aroA i dam. Na modelu mysim zaobserwowano

silną odpowiedź zależną od limfocytów T CD8+, która efek-

tywnie powstrzymała powstanie przerzutów do płuc [38].

Innym endogennym inhibitorem angiogenezy jest trombo-

spondyna 1 (TSP-1), której zdolność do zahamowania wzro-

stu czerniaka oraz przerzutów została już udokumentowa-

na in vitro i in vivo [59]. W badaniach na myszach przepro-

wadzonych przez Lee i wsp. dootrzewnowe wstrzyknięcie

bakterii gatunku Salmonella choleraesuis niosących plazmid

kodujący trombospondynę 1 powodowało zahamowanie

wzrostu i zmniejszenie rozmiarów guzów (czerniaka), co

związane było z redukcją unaczynienia guzów [60]. Dodat-

kowo badano szczepy Bifidobacterium adolescentis i longum z

plazmidami zawierającymi gen kodujący endostatynę (in-

hibitor procesu angiogenezy). Szczepy (podane dożylnie)

docierały wyłącznie do guzów wątroby hamując proces an-

giogenezy i wzrost tych guzów [61,62].

Innym stosunkowo nowatorskim podejściem w walce

z nowotworami jest immunizacja przeciwko molekułom

nadeksprymowanym przez makrofagi związane z guzem,

które to molekuły stymulują proliferację komórek nowo-

tworowych oraz proces metastazy poprzez sekrecję czynni-

ków wzrostu oraz czynników pro-angiogennych. Leguma-

ina (ang. legumain) jest silnie nadeksprymowana przez ma-

krofagi w tkankach wielu rodzajów nowotworów. Zaszcze-

pienie myszy szczepem S. enterica sv. Typhimurium aroA

dam kodującym gen legumainy prowadziło do odpowiedzi

limfocytów T CD8+ przeciwko makrofagom związanym z

guzem, prowadząc do supresji angiogenezy, zahamowania

wzrostu guza i zapobiegnięcia powstawania przerzutów w

wyniku zaburzeń mikrośrodowiska guza [38].

W leczeniu istniejących już guzów oraz zapobieganiu na-

wrotów najefektywniejszą terapią wydaje się połączenie tra-

dycyjnej chemioterapii z immunoterapią. Przykładem takiej

kombinowanej terapii było doustne zaaplikowanie myszom

komórek Salmonella będących nośnikiem genu kodującego

płytkopochodny czynnik wzrostu B, nadeksprymowanego

w proliferujących endotelialnych komórkach naczyń krwio-

nośnych guza, wraz z leczeniem przy użyciu cyklofosfa-

midu, szeroko stosowanego leku cytostatycznego. Terapia

ta nie tylko spowodowała zahamowanie wzrostu wielu

rodzajów nowotworów, ale także odrzucenie guza (ang.

tumor rejection) [63]. Jest to jedno z wielu badań potwierdza-

jących zasadność stosowania terapii łączonych w celu uzy-

skania maksymalnego efektu antynowotworowego. Jed-

nym z głównych problemów tradycyjnej chemioterapii jest

nabywanie wielolekowej oporności (MDR, ang. multidrug

resistance) przez komórki nowotworowe, co uniemożliwia

kontynuację konwencjonalnego leczenia. Jako alternatywę

dla leczenia takich przypadków podjęto próbę wykorzysta-

nia immunoterapii z użyciem bakterii. W celu złamania ob-

wodowej tolerancji limfocytów T, na wektorze obecnym w

komórkach S. enterica sv. Typhimurium wprowadzono gen

kodujący białko MRP1 (ang. multidrug resistance-associated

protein 1). Doustne podanie tej szczepionki myszom, dopro-

wadziło do wywołania specyficznej wobec antygenu od-

powiedzi zależnej od limfocytów T CD8+ i wydłużyło czas

życia zaszczepionych zwierząt [64]. Tak więc zastosowanie

bakterii jako wektorów produkujących odpowiedni anty-

gen stanowi obiecującą strategię do przełamania tolerancji

układu odpornościowego wobec antygenów nadeksprymo-

wanych przez komórki nowotworowe, szczególnie jeśli te-

rapia ta łączona jest z tradycyjną chemio- czy radioterapią.

322

www.postepybiochemii.pl

ZASTOSOWANIE MIKROORGANIZMÓW

JAKO NOŚNIKÓW GENÓW MODULUJĄCYCH

AKTYWNOŚĆ UKŁADU ODPORNOŚCIOWEGO

Siła odpowiedzi immunologicznej wobec LBV może ulec

znacznemu zwiększeniu w wyniku modyfikacji wektorów

ekspresyjnych, bądź przez koekspresję immunostymula-

torów. Pośród organizmów, nośników, atenuowane szcze-

py Salmonella okazały się jak do tej pory najatrakcyjniejsze

i najskuteczniejsze zarówno w aspekcie profilaktycznym,

jak i terapeutycznym. Poza zastosowaniem bakterii rodza-

ju Salmonella do konstrukcji szczepionek eksprymujących

specyficzny dla nowotworu antygen, bakteria ta wykorzy-

stywana jest również w immunoterapii raka jako nośnik

dostarczający stymulujące układ odpornościowy cytokiny,

między innymi ludzki gen kodujący interleukinę 2 (IL-2).

IL-2 to cytokina o wielkości 15 kDa, produkowana

przez zaktywowane komórki T CD4+ oraz inne komór-

ki układu odpornościowego. Odgrywa kluczową rolę w

generacji i regulacji odpowiedzi odpornościowej, dlatego

też jest potencjalnym czynnikiem antynowotworowym.

IL-2 aktywuje proliferację limfocytów i przyczynia się

do wzmocnienia cytolitycznych właściwości komórek T

i NK. Zastosowanie IL-2 w przypadku terapii niektórych

nowotworów, jak na przykład raka nerki czy czerniaka,

okazało się stosunkowo skuteczne, aczkolwiek zastoso-

wanie wysokich (silnie toksycznych) dawek IL-2 u wie-

lu pacjentów objawiało się m.in. gorączką, obrzękiem,

gwałtownym spadkiem ciśnienia, żółtaczką i dysfunkcją

nerek, w skrajnych przypadkach prowadzącą do śmier-

ci [65]. Dlatego też badania naukowców skupiły się na

zmniejszeniu efektów ubocznych poprzez manipulację

dawką, drogą czy częstością aplikowania; zabiegi te nie

przyniosły jednak początkowo oczekiwanych efektów.

W nadziei na znalezienie skutecznego sposobu lokalne-

go dostarczenia IL-2, w wyniku którego zachowany był-

by efekt terapeutyczny przy zmniejszeniu do minimum

ogólnej toksyfikacji organizmu, rozpoczęto badania nad

skonstruowaniem atenuowanego szczepu S. enterica sv.

Typhimurium, w których dochodziło by do lokalnej syn-

tezy IL-2 w rejonach kolonizowanych przez bakterie. Jed-

ne z pierwszych badań z zastosowaniem Salmonella eks-

prymującej IL-2, przeprowadzone przez Sorensona i wsp.

dotyczyły nieoperowalnego raka wątroby, dla którego

nieznana jest obecnie skuteczna terapia; nowotwór ten

wiąże się z bardzo złymi rokowaniami. Skonstruowano

atenuowany szczep Salmonella χ4550, do którego wpro-

wadzono plazmid pYA292 zawierający ludzki gen kodu-

jący IL-2. Konstrukt ten zaaplikowano doustnie myszom

C57BL/6, którym uprzednio wstrzyknięto do śledziony

komórki MCA-38 mysiego gruczolakoraka. Jest to dobrze

opisany i powtarzalny model dla analizy selektywnej ge-

neracji przerzutów wątrobowych. Podanie rekombino-

wanej Salmonella eksprymującej IL-2 skutkowało zmniej-

szeniem liczby guzów przerzutowych w porównaniu ze

zwierzętami kontrolnymi bądź zwierzętami, którym za-

aplikowano bakterie Salmonella z pustym wektorem. W

dalszej kolejności badania tego samego zespołu wykaza-

ły, że komórki NK oraz limfocyty T CD8+ są jednym z

głównych mediatorów efektu antynowotworowego wy-

woływanego przez IL-2 [66].

Kolejne badania pozwoliły na efektywne zastosowanie

konstruktu Salmonella-pIL2 jako formy bioterapii do lokal-

nego dostarczenia IL-2 do nerwiaka płodowego, złośliwe-

go nowotworu wywodzącego się z neuroblastów, komórek

cewy nerwowej, będącego najczęstszym z nowotworów

spotykanych u niemowląt. W badaniach na modelu my-

sim, u zwierząt z wstrzykniętymi zaotrzewnowo komórka-

mi Neuro-2a (N2a) nerwiaka płodowego, zaobserwowano

znaczną redukcję rozmiaru i ciężaru guzów u myszy trak-

towanych S. enterica sv. Typhimurium lub Salmonella-pIL2

w stosunku do tych, którym nie zaaplikowano bakterii.

Antynowotworowy efekt zaobserwowany w przypadku

Salmonella-pIL2 był większy niż w przypadku podania sa-

mej bakterii. Pojedyncze doustne zastosowanie Salmonella i

Salmonella-pIL2 prowadziło do redukcji guza odpowiednio

o 63% i 84% w stosunku do kontroli. Obserwowany efekt

może znacznie zwiększyć procent przeżywalności dzieci z

wyższym stopniem zaawansowania tego nowotworu [67].

Jednym z nowszych badanych przykładów zastosowania

Salmonella-pIL2 jako adiuwanta w terapii antynowotworo-

wej jest użycie tego konstruktu w zapobieganiu przerzutów

do płuc u pacjentów z mięsakiem kościopochodnym (ina-

czej: kostniakomięsak, OS i osteosarcoma). Wcześniej już

wykazano zdolność SalpIL-2 do redukcji wielkości i masy

guzów przerzutowych OS do płuc, następnie badano sku-

teczność zapobiegania tym przerzutom poprzez zastoso-

wanie jednej doustnej dawki SalpIL-2 [66,68]. Pozytywne

długoterminowe prognozy dotyczą pacjentów, u których

w wyniku zastosowania chemioterapii nastąpiła nekroza

przynajmniej 90% guza pierwotnego oraz mających niską

zawartość we krwi białka ezryny biorącej udział w procesie

metastazy. Doustne podanie SalpIL-2 pozwala bakteriom

podążać naturalną drogą infekcji i kolonizować różne tkan-

ki z uwzględnieniem kępek Peyera, wątroby, płuc i śledzio-

ny. Na podstawie otrzymanych w doświadczeniu wyników

potwierdzona została hipoteza zakładająca zwiększenie

odpowiedzi odpornościowej komórek NK po doustnym

podaniu SalpIL-2 [66]. Jednakże ostateczne zastosowanie

tego szczepu w terapiach wymaga doprecyzowania losu

rekombinowanej Salmonella w organizmie gospodarza oraz

oszacowania czy infekcje SalpIL-2 nie powodują toksyczno-

ści związanej z nadmiarem IL-2.

W badaniach przeprowadzonych przez Al-Ramadi i

współpracowników testowano skuteczność szczepu GI-

DIL2 Salmonella. GIDIL2 jest pochodną szczepu BRD509

(mutanta w genach aroA i aroD) eksprymującą gen ludzkiej

IL-2 pod kontrolą promotora indukowanego w warunkach

beztlenowych. Tak skonstruowany szczep wstrzyknięto

myszom C57BL/6 z czerniakiem (linia komórkowa B16.

F1). Antynowotworowy efekt, nekrozę guza oraz redukcję

gęstości sieci naczyń krwionośnych wokół guza, obserwo-

wano zarówno w przypadku szczepu GIDIL2 jak i szczepu

BRD509, efekt ten był jednak znacznie silniejszy w przypad-

ku administracji szczepu eksprymującego IL-2. Wielokrot-

ne podanie niższych dawek GIDIL2 pozwoliło na znaczne

zmniejszenie efektu toksycznego obserwowanego w przy-

padku jednokrotnej wysokiej dawki powodującej silne za-

burzenia metaboliczne jako wynik masowej śmierci wielu

komórek nowotworowych [69].

Postępy Biochemii 58 (3) 2012

323

Rekombinowane szczepy Salmonella są obecnie głów-

nym narzędziem w terapii antynowotworowej specyficz-

nie dostarczającej IL-2 jako adiuwant. Podjęto również

próby wykorzystania w tym celu innych rodzajów bak-

terii. Barbé i wsp. skonstruowali szczep Clostridium ace-

tobutylicum DSM792 eksprymujący szczurzą IL-2 (rIL-2),

której biologiczna aktywność została oceniona przez ba-

danie zdolności do indukcji proliferacji limfocytów T (ba-

dania in vitro) [70]. Uprzednie badania z wykorzystaniem

Clostridium wykazywały, że bakteria ta nie jest zdolna do

kolonizacji niewielkich guzów przerzutowych, co ogra-

niczałoby jej zastosowanie jedynie do leczenia guzów o

odpowiednio dużych rozmiarach. Pionierskie badania

nad zastosowaniem Clostridium do produkcji cytokin

pobudzających układ odpornościowy zwróciły uwagę

naukowców na nowe możliwości wykorzystania bakterii

w terapiach antynowotworowych, zarówno do dostar-

czenia TNFα, jak i IL-2. Kolejnym krokiem będzie ocena

efektywności Clostridium produkującej IL-2 w testach na

zwierzętach.

Prowadzone są również badania z wykorzystaniem

prątków Bacillus Calmette-Guérin (BCG) jako nośników

genu kodującego IL-2. Prątki BCG stosowane są w lecze-

niu powierzchniowych nowotworów pęcherza moczowe-

go od ponad 30 lat. Pomimo tak długiej historii w lecze-

niu tych nowotworów i postulowania udziału wielu cy-

tokin, nadal wiele szczegółów dotyczących mechanizmu

antynowotworowego działania prątków BCG pozostaje

niewyjaśnionych. Prątki BCG w leczeniu powierzchnio-

wych nowotworów pęcherza moczowego okazały się

bardzo skuteczną terapią adiuwantową, zapobiegając

w wielu przypadkach nawrotom choroby oraz hamując

wzrost guza [6,71]. Terapia ta obarczona jest jednak dość

poważnymi efektami ubocznymi. Ponadto, około 30–40%

pacjentów z powierzchniowym nowotworem układu mo-

czowego nie odpowiada na leczenie prątkami BCG, a u

znacznej części pacjentów, u których wyleczono tę cho-

robę dzięki BCG, następuje nawrót choroby w przeciągu

kilku lat od początkowego wyleczenia. W celu optyma-

lizacji terapii z użyciem BCG podjęto próby dostarcze-

nia prątków BCG wraz z INF-a bądź IL-2. W obu przy-

padkach terapia kombinowana wykazała większy efekt

antynowotworowy niż podanie samych prątków BCG w

takiej samej, niskiej dawce i efekt ten był porównywalny

z efektem wysokiej dawki BCG, która jednak wiąże się

z wysoką toksycznością [72].

Przeprowadzono też kilka eksperymentów mających

na celu stymulację układu odpornościowego przez inne

niż IL-2 preparaty. Ligand Flt3 (Flt3L, ang. FMS-like tyrosi-

ne kinase 3 ligand) stymuluje namnażanie komórek układu

odpornościowego, działa jak czynnik wzrostu. Poprzednie

badania udokumentowały umiarkowane antynowotworo-

we właściwości tej cząsteczki, Yoon i wsp. postanowili więc

zwiększyć cytotoksyczny efekt Flt3L poprzez dostarczenie

jej na wektorze niesionym przez S. Typhimurium. Podskór-

ne zaaplikowanie myszom z czerniakiem bakterii z rodzaju

Salmonella eksprymujących Flt3L powodowało zahamowa-

nie wzrostu guzów oraz zwiększenie przeżywalności zwie-

rząt w porównaniu z myszami kontrolnymi [73].

Wyniki niektórych doświadczeń wskazują, że immu-

nizacja terapeutyczna przy użyciu nośnika dostarczają-

cego zarówno antygen jak i cytokinę skutkuje wzmożoną

odpowiedzią odpornościową. Wykazano, że jednoczesne

dostarczenie przez S. enterica sv. Typhimurium mysiego

genu FLK-1 oraz IL-12 było efektywniejsze w redukcji una-

czynienia guza, sugerując synergistyczny efekt działania

produktów obu dostarczonych genów. Inną cytokiną o po-

tencjalnym zastosowaniu w terapii antynowotworowej jest

IL-18, wzmagająca produkcję cytokin przez limfocyty T i

komórki NK oraz indukująca ich aktywność proliferacyjną

i cytolityczną. Dostarczenie samej IL-18 przy użyciu jako

nośnika S. enterica sv. Typhimurium prowadziło do znacz-

nej regresji przerzutów pierwotnego raka piersi u myszy.

Dostarczenie tej cytokiny w kombinacji z plazmidem kodu-

jącym antygen specyficzny dla raka piersi myszy (antygen

1 związany z czynnikiem transkrypcyjnym Fos) w fuzji z

ubikwityną, prowadziło do jeszcze silniejszej odpowiedzi

odpornościowej. Koadministracja IL-18 działała jako silny

i naturalny adiuwant i zapewniła odpowiednie warunki do

aktywacji limfocytów T CD8+ i CD4+ oraz komórek NK,

indukując silną specyficzną wobec nowotworu odpowiedź

cytotoksyczną odznaczającą się długotrwałą pamięcią lim-

focytów T przeciw nawrotom guza [38]. Innym przykła-

dem było dostarczenie przez atenuowany szczep S. enteri-

ca sv. Typhimurium aroA

-

dam

-

chemokiny CCL21 wraz z

surwiwiną, inhibitorem apoptozy, nadeksprymowanym w

znacznej większości guzów litych. Chemokina CCL21 jest

chemoatraktantem aktywującym prezentujące antygen ko-

mórki dendrytyczne i naiwne limfocyty T, powodującym

ich gromadzenie się w grudkach limfoidalnych i wtórnych

narządach limfatycznych w celu wywołania efektywnej od-

powiedzi zależnej od limfocytów T. Jednoczesne dostarcze-

nie CCL21 i surwiwiny powodowało aktywację komórek

dendrytycznych prezentujących antygen oraz wywołanie

silnej odpowiedzi z udziałem limfocytów T CD8+ zarówno

w modelu profilaktycznym, jak i terapeutycznym guzów

przerzutowych do płuc [74].

PODSUMOWANIE — PROBLEMY ORAZ

PERSPEKTYWY DOTYCZĄCE WYKORZYSTANIA

BAKTERII JAKO WEKTORÓW W TERAPIACH

ANTYNOWOTWOROWYCH

Efektywne dostarczenie odpowiedniego genu specy-

ficznie do wybranej tkanki lub grupy komórek jest głów-

ną trudnością w terapii genowej. Wstrzyknięcie „nagich“

szczepionek DNA do guza w wielu przypadkach powo-

dowało zbyt niską immunogenność, ponadto nie rozwią-

zywało problemu dostarczenia pożądanych genów do nie-

zdiagnozowanych przerzutów, konieczne więc stało się po-

szukiwanie optymalnego nośnika. Systemy stosowane do

dostarczania do komórek nowotworowych odpowiednich

genów podzielić można na sposoby biologiczne (bakterie i

wirusy) oraz nie biologiczne (chemiczne i fizyczne). Pomi-

mo wysokiej skuteczności, zastosowanie wektorów wiru-

sowych budzi kontrowersje ze względów bezpieczeństwa;

ponadto, produkcja i stosowanie wektorów wirusowych

jest znaczniej bardziej skomplikowana niż użycie wektorów

bakteryjnych. Systemy chemiczne, takie jak dostarczenie

DNA w liposomach, kationowych peptydach czy polime-

324

www.postepybiochemii.pl

rach, jak i sposoby fizyczne: elektro- i sonoporacja są obec-

nie znacznie mniej efektywne od sposobów biologicznych,

niektóre z nich wiążą się z wysokimi kosztami produkcji,

a jednocześnie okres ekspresji tak dostarczonego transgenu

jest zazwyczaj dość krótki [3].

Podobnie jak w przypadku wirusów, biologiczne właści-

wości bakterii pozwalają na efektywne dostarczenie DNA

do komórek lub tkanek. Ze względów bezpieczeństwa za-

stosowanie jako wektorów patogennych gatunków bakterii

wymaga konstrukcji atenuowanych szczepów, które zacho-

wałyby pożądane cechy idealnego wektora, takie jak wyso-

ka immunogenność oraz zdolność do kierowania się do re-

jonu guza bądź do inwazji enterocytów, przy jednoczesnej

znikomej toksyczności dla całego organizmu. Problemami,

z jakimi boryka się nowoczesna terapia antynowotworowa

wykorzystująca bakterie jako żywe wektory, to poza ko-

niecznością konstrukcji szczepów atenuowanych również

fakt stosunkowo szybkiej utraty plazmidu zawierającego

gen efektorowy przez bakterie, a także ryzyko lateralnego

transferu genów oporności do innych bakterii i rozprze-

strzenianie wektora w środowisku. W przypadku zastoso-

wania bakterii do dostarczania genów kodujących enzymy

przekształcające nieaktywny prolek w jego aktywną tok-

syczną formę niezbędne jest zabezpieczenie przed ekspresją

genu efektorowego poza pożądanym miejscem docelowym.

W tym celu prowadzone są badania nad wprowadzeniem

promotorów pozwalających na regulację procesu ekspresji

genu, jak na przykład promotora indukowanego warun-

kami hipoksji lub promieniowaniem jonizującym. Badania

koncentrują się na opracowaniu metod przedłużenia czasu

ekspresji pożądanego genu, ustaleniu optymalnych dawek i

sposobu podania bakterii oraz podwyższeniu poziomu od-

powiedzi odpornościowej, na przykład poprzez zastosowa-

nie niektórych cytokin [4,9].

Postęp badań znacząco przyśpiesza rozwój metod inży-

nierii genetycznej oraz opracowanie w ostatnich latach co-

raz to doskonalszych metod sekwencjonowania genomów

bakteryjnych. Nadal jednak wiele zagadnień wymaga wy-

jaśnienia: jak efektywne jest w wypadku ludzkich terapii

kierowanie się bakterii do guza w zależności od wielkości

guza i jego położenia oraz ukrwienia; czy wprowadzane

wektory podlegają atakowi immunologicznemu w guzach

oraz czy replikują się w nowotworach, a w związku z tym

czy efekt terapeutyczny ulega amplifikacji. Pomimo wymie-

nionych problemów, terapia z zastosowaniem mikroorgani-

zmów jako wektorów nośników genów kodujących enzymy

aktywujące proleki może okazać się skuteczna, szczególnie

w połączeniu z terapią tradycyjną, np. radioterapią czy che-

mioterapią. Problemem terapii konwencjonalnych jest fakt,

że działają efektywniej w rejonach mocno unaczynionych,

co często uniemożliwia dotarcie do hipoksyjnych stref guza.

Terapia z zastosowaniem bakterii koncentruje się natomiast

na rejonach hipoksji i anoksji, uzupełniając się w ten spo-

sób skutek działania terapii tradycyjnej. Badania wykazały,

że terapie te działają na inne subpopulacje komórek, efekt

równoczesnego ich zastosowania okazuje się, więc być ad-

dytywny. Połączenie obu metod umożliwiłoby znaczne

zmniejszenie dawki stosowanych chemioterapeutyków,

obniżając w ten sposób toksyczność terapii dla całego orga-

nizmu [3,9,38].

Zastosowanie szczepionek DNA z użyciem żywych bak-

terii jest obiecującą strategią walki z rakiem, jednak poza

koniecznością wywoływania odpowiednio silnej odpowie-

dzi odpornościowej skierowanej przeciwko dostarczanym

antygenom, muszą też okazać się całkowicie bezpieczne

dla pacjentów. Trudne jest uzyskanie pożądanej równowa-

gi pomiędzy immunogennością i bezpieczeństwem, pro-

wadzące do wywołania odpowiednio silnej odpowiedzi

odpornościowej przy jednoczesnej minimalizacji efektów

ubocznych. Pomimo istniejących wciąż pewnych proble-

mów i niejasności związanych z zastosowaniem LBV, co-

raz bardziej szczegółowa wiedza na temat funkcjonowania

systemu odpornościowego wraz z obiecującymi wynikami

badań przedklinicznych i klinicznych sprawia, że produk-

cja szczepionek specyficznych wobec nowotworu wydaje

się realna. Pośród możliwych strategii szczepienia, doślu-

zówkowa administracja z użyciem żywych atenuowanych

bakterii okazała się najbardziej obiecująca. Jako jedne z

głównych zalet tej strategii wymienić należy niewątpliwie

zdolność do stymulacji wrodzonego układu odpornościo-

wego, a więc naturalne właściwości adiuwantowe, bezpie-

czeństwo oraz łatwość manipulacji genetycznych [38].

PIŚMIENNICTWO

1. Anderson RJ, Schneider J (2007) Plasmid DNA and viral vector-based

vaccines for the treatment of cancer. Vaccine 25: B24-B34

2. Stevenson FK, Rice J, Ottensmeier CH, Thirdborough SM, Zhu D

(2004) DNA fusion gene vaccines against cancer: from the laboratory

to the clinic. Immunol Rev 199: 156-180

3. Baban CK, Cronin M, O’Hanlon D, O’Sullivan GC, Tangney M (2010)

Bacteria as vectors for gene therapy of cancer. Bioengineered Bugs 1:

385-394

4. Wei MQ, Mengesha A, Good D, Anné J (2008) Bacterial targeted tumo-

ur therapy-dawn of a new era. Cancer Lett 259: 16-27

5. Cao S, Cripps A, Wei MQ (2010) New strategies for cancer gene the-

rapy: progress and opportunities. Clin Exp Pharmacol Physiol 37: 108-

114

6. Shintani Y, Sawada Y, Inagaki T, Kohjimoto Y, Uekado Y, Shinka T

(2007) Intravesical instillation therapy with bacillus Calmette–Guerin

for superficial bladder cancer: study of the mechanism of bacillus Cal-

mette–Guerin immunotherapy. Int J Urol 14: 140-146

7. Uyl-de Groot CA, Vermorken JB, Hanna MG Jr, Verboom P, Groot

MT, Bonsel GJ, Meijer CJ, Pinedo HM (2005) Immunotherapy with au-

tologous tumor cell-BCG vaccine in patients with colon cancer: a pro-

spective study of medical and economic benefits. Vaccine 23: 2379-87

8. Goldman B, DeFrancesco L (2009) The cancer vaccine roller-coster. Nat

Biotechnol 27 :129-39

9. Pawelek JM, Low KB, Bermudes D (2003) Bacteria as tumor-targeting

vector. Lancet Oncol 4: 548-556

10. Ryan RM, Green J, Lewis CE (2006) Use of bacteria in anti-cancer the-

rapies. Bioessays 28: 84-94

11. Theys J, Barbé S, Landuyt W, Nuyts S, Van Mellaert L, Wouters B,

Anné J, Lambin P (2003) Tumor-Specific Gene Delivery Using Geneti-

cally Engineered Bacteria. Curr Gene Ther 3: 207-221

12. Zhao M, Yang M, Li XM, Jiang P, Baranov E, Li S, Xu M, Penman S,

Hoffman RM (2005) Tumor-targeting bacterial therapy with amino

acid auxotrophs of GFP-expressing Salmonella typhimurium. Proc Natl

Acad Sci USA 102: 755-760

13. Clairmont C, Lee KC, Pike J, Ittensohn M, Low KB, Pawelek J, Bermu-

des D, Brecher SM, Margitich D, Turnier J, Li Z, Luo X, King I, Zheng

LM (2000) Biodistribution and genetic stability of the novel antitumo-

ur agent VNP20009, a genetically modified strain of Salmonella typhi-

murium. J Infect Dis 18: 1996-2002

Postępy Biochemii 58 (3) 2012

325

14. Low KB, Ittensohn M, Luo X, Zheng LM, King I, Pawelek JM, Ber-

mudes D (2004) Construction of VNP20009: a novel, genetically stable

antibiotic-sensitive strain of tumor-targeting Salmonella for parenteral

administration in humans. Methods Mol Med 90: 47-60

15. Toso JF, Gill VJ, Hwu P, Marincola FM, Restifo NP, Schwartzentruber

DJ, Sherry RM, Topalian SL, Yang JC, Stock F, Freezer LJ, Morton KE,

Seipp C, Haworth L, Mavroukakis S, White D, MacDonald S, Mao J,

Sznol M, Rosenberg SA (2002) Phase I Study of the Intravenous Ad-

ministration of Attenuated Salmonella typhimurium to Patients With

Metastatic Melanoma. J Clin Oncol 20: 142-152

16. Jia LJ, Wei DP, Sun QM, Huang Y, Wu Q, Hua ZC (2007) Oral delivery

of tumor-targeting Salmonella for cancer therapy in murine tumor mo-

dels. Cancer Sci 98: 1107-1112

17. Lee CH, Wu CL, Tai YS, Shiau AL (2005) Systemic administration of

attenuated Salmonella choleraesuis in combination with cisplatin for

cancer therapy. Mol Ther 11: 707-716

18. Platt J, Sodi S, Kelley M, Rockwell S, Bermudes D, Low KB, Pawelek J

(2000) Antitumour effects of genetically engineered Salmonella in com-

bination with radiation. Eur J Cancer 36: 2397-2402

19. Dang LH, Bettegowda C, Huso DL, Kinzler KW, Vogelstein B (2001)

Combination bacteriolytic therapy for the treatment of experimental

tumours. Proc Natl Acad Sci USA 98: 15155-15160

20. Agrawal N, Bettegowda C, Cheong I, Geschwind JF, Drake CG, Hip-

kiss EL, Tatsumi M, Dang LH, Diaz LA Jr, Pomper M, Abusedera M,

Wahl RL, Kinzler KW, Zhou S, Huso DL, Vogelstein B (2004) Bacterio-

lytic therapy can generate a potent immune response against experi-

mental tumors. Proc Natl Acad Sci USA 101: 15172-15177

21. www.clinicaltrials.gov/ct
22. Yazawa K, Fujimori M, Amano J, Kano Y, Taniguchi S (2000) Bifodobac-

terium longum as a delivery system for cancer gene therapy: selective

localization and growth in hypoxic tumors. Cancer Gene Ther 7: 269-

274

23. Pawelek JM, Low KB, Bermudes D (1997) Tumor-targeted Salmonella

as a novel anticancer vector. Cancer Res 57: 4537-4544

24. Bermudes D, Low B, Pawelek JM (2000) Tumour-targeted Salmonella:

strain development and expression of the HSV TK effector gene. W:

Walther W, Stein U (Eds). Gene therapy: methods and protocols. Toto-

wa: Humana Press 419-436

25. Fu W, Lan H, Liang S, Gao T, Ren D (2008) Suicide gene/prodrug the-

rapy using Salmonella-mediated delivery of Escherichia coli purine nuc-

leoside phosphorylase gene and 6-methoxypurine 2′-deoxyriboside in

murine mammary carcinoma 4T1 model. Cancer Sci 99: 1172-1179

26. Deharvengt S, Wack S, Uhring M, Aprahamian M, Hajri A (2004) Su-

icide gene/prodrug therapy for pancreatic adenocarcinoma by E. coli

purine nucleoside phosphorylase and 6-methylpurine 2′-deoxyribosi-

de. Pancreas 28: 54-56

27. King I, Bermudes D, Lin S, Belcourt M, Pike J, Troy K, Le T, Ittensohn

M, Mao J, Lang W, Runyan JD, Luo X, Li Z, Zheng LM (2002) Tumor-

-targeted Salmonella expressing cytosine deaminase as an anticancer

agent. Hum Gene Ther 13: 1225-1233

28. Nemunaitis J, Cunningham C, Senzer N, Kuhn J, Cramm J, Litz C, Ca-

vagnolo R, Cahill A, Clairmont C, Sznol M (2003) Pilot trial of gene-

tically modified, attenuated Salmonella expressing the E. coli cytosine

deaminase gene in refractory cancer patients. Cancer Gene Ther 10:

737- 744

29. Friedlos F, Lehouritis P, Ogilvie L, Hedley D, Davies L, Bermudes D,

King I, Martin J, Marais R, Springer CJ (2008) Attenuated Salmonella

targets prodrug activating enzyme carboxypeptidase G2 to mouse me-

lanoma and human breast and colon carcinomas for effective suicide

gene therapy. Clin Cancer Res 14: 4259-4266

30. Clairmont C, Lee KC, Pike J, Ittensohn M, Low KB, Pawelek J, Ber-

mudes D, Brecher SM, Margitich D, Turnier J, Li Z, Luo X, King I,

Zheng LM (2000) Biodistribution and genetic stability of the novel an-

titumor agent VNP20009, a genetically modified strain of Salmonella

typhimurium. J Infect Dis 181: 1996-2002

31. Ganai S, Arenas RB, Forbes NS (2009) Tumour-targeted delivery of

TRAIL using Salmonella typhimurium enhances breast cancer survival

in mice. Br J Cancer 101: 1683-1691

32. Hu B, Kou L, Li C, Zhu LP, Fan YR, Wu ZW, Wang JJ, Xu GX (2009)

Bifidobacterium longum as a delivery system of TRAIL and endostatin

cooperates with chemotherapeutic drugs to inhibit hypoxic tumor

growth. Cancer Gene Ther 16: 655-663

33. Groot AJ, Mengesha A, van der Wall E, van Diest PJ, Theys J, Vooijs

M (2007) Functional antibodies produced by oncolytic clostridia. Bio-

chem Biophys Res Commun. 364: 985-989

34. Tang W, He Y, Zhou S, Ma Y, Liu G (2009) A novel Bifidobacterium

infantis-mediated TK/GCV suicide gene therapy system exhibits an-

titumor activity in a rat model of bladder cancer. J Exp Clin Canc Res

28: 155

35. Yazawa K, Fujimori M, Amano J, Kano Y, Taniguchi S (2007) Bifidobac-

terium longum as a delivery system for cancer gene therapy: Selective

localization and growth in hypoxic tumors. Biosci Biotechol Biochem

71: 2921-2926

36. Coban C, Koyama S, Takeshita F, Akira S, Ishii KJ (2008) Molecular

and cellular mechanisms of DNA vaccines. Hum Vaccin 4: 453-456

37. Fioretti D, Iurescia S, Fazio VM, Rinaldi M (2010) DNA vaccines: deve-

loping new strategies against cancer. J Biomed Biotechnol 2010: 174378

38. Daudel D, Weidinger G, Spreng S (2007) Use of attenuated bacteria

as delivery vectors for DNA vaccines. Expert Rev Vaccines 6: 97-110

39. Krieg AM (2007) Antiinfective Applications of Toll-like Receptor 9

Agonists. Proc Am Thorac Soc 4: 289-294

40. Conry RM, Curiel DT, Strong TV, Moore SE, Allen KO, Barlow DL,

Shaw DR, LoBuglio AF (2002) Safety and immunogenicity of a DNA

vaccine encoding carcinoebryonic antigen and hepatitis B surface an-

tigen in colorectal carcinoma patients. Clin Cancer Res 8: 2782-2787

41. Triozzi PL, Aldrich W, Allen KO, Carlisle RR, LoBuglio AF, Conry

RM (2005) Phase I study of plasmid DNA vaccine encoding MART-1

in patiens with resected elanoma at risk of relapse. J Immunother 28:

382-388

42. Lowe DB, Shearer MH, Kennedy RC (2006) DNA vaccines: successes

and limitations in cancer and infectious disease. J Cel Biochem 98: 235-

242

43. Wahid R, Pasetti MF, Maciel M Jr, Simon JK, Tacket CO, Levine MM,

Sztein MB (2011) Oral priming with Salmonella Typhi vaccine strain

CVD 909 followed by parenteral boost with the S. typhi Vi capsular

polysaccharide vaccine induces CD27+IgD− S. typhi-specific IgA and

IgG B memory cells in humans. Clin Immunol 138: 187-200

44. Tacket CO, Sztein MB, Wasserman SS, Losonsky G, Kotloff KL, Wyant

TL, Nataro JP, Edelman R, Perry J, Bedford P, Brown D, Chatfield S,

Dougan G, Levine MM (2000) Phase 2 Clinical Trial of Attenuated Sal-

monella enterica Serovar Typhi Oral Live Vector Vaccine CVD 908-htrA

in U.S. Volunteers. Infect Immun 68: 1196-1201

45. Zhang XL, Jeza VT, Pan Q (2008) Salmonella typhi: from a human patho-

gen to a vaccine vector. Cell Mol Immunol 5: 91-7

46. Kopecko DJ, Sieber H, Ures JA, Fürer A, Schlup J, Knof U, Collioud A,

Xu D, Colburn K, Dietrich G (2009) Genetic stability of vaccine strain

Salmonella typhi Ty21a over 25 years. Int J Med Microbiol 299: 233-246

47. Tacket CO, Sztein MB, Losonsky GA, Wasserman SS, Nataro JP, Edel-

man R, Pickard D, Dougan G, Chatfield SN, Levine MM (1997) Safety

of live oral Salmonella typhi vaccine strains with deletions in htrA and

aroC aroD and immune response in humans. Infect Immun 65: 452-456

48. Tran TH, Nguyen TD, Nguyen TT, Ninh TT, Tran NB, Nguyen VM,

Tran TT, Cao TT, Pham VM, Nguyen TC, Tran TD, Pham VT, To SD,

Campbell JI, Stockwell E, Schultsz C, Simmons CP, Glover C, Lam W,

Marques F, May JP, Upton A, Budhram R, Dougan G, Farrar J, Nguyen

VV, Dolecek C (2010) A randomised trial evaluating the safety and im-

munogenicity of the novel single oral dose typhoid vaccine M01ZH09

in healthy Vietnamese children. PLoS One 5: e11778

49. Shahabi V, Maciag PC, Rivera S, Wallecha A (2010) Live, attenuated

strains of Listeria and Salmonella as vaccine vectors in cancer treatment.

Bioengineered Bugs 1: 235-243

50. Schroeder GN, Hilbi H (2008) Molecular pathogenesis of Shigella spp.:

controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secre-

tion. Clin Microbiol Rev 21: 134-156

326

www.postepybiochemii.pl

Application of microorganisms as delivery vehicles in cancer gene therapies

Katarzyna Łepeta, Anna Maria Łasica, Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka

*

Department of Bacterial Genetics, Institute of Microbiology, Faculty of Biology, University of Warsaw, 1 Miecznikowa Str., 02-096 Warsaw, Poland

*

e-mail: [e-mail]

Key words: cancer, DNA vaccine, gene therapy, gene delivery vectors, LBV

ABSTRACT

Gene therapy represents a potential new strategy for cancer treatment. In order to deliver a transgene into target tumor cells, a vector system

is required. To date, most of the cancer therapies are based on the use of different viral vectors. However, bacteria such as

Salmonella, Clos-

tridium or non-pathogenic Bifidobacterium can selectively accumulate in tumors in vivo what renders them useful for cancer gene therapy

vectors. Although the mechanism of DNA transfer from bacteria to mammalian cells is not completely understood their potential to deliver

therapeutic genes into tumor cells have been demonstrated

in vitro and in vivo. The review presents recent achievements in bacteria-mediated

cancer gene therapy.

51. Darji A, Mohamed W, Domann E, Chakraborty T (2003) Induction of

immune responses by attenuated isogenic mutant strains of Listeria

monocytogenes. Vaccine 21 Suppl 2: S102-109

52. Johnson PV, Blair BM, Zeller S, Kotton CN, Hohmann EL (2011) Atte-

nuated Listeria monocytogenes vaccine vectors expressing influenza A

nucleoprotein: preclinical evaluation and oral inoculation of volunte-

ers. Microbiol Immunol 55: 304-317

53. Brockstedt DG, Giedlin MA, Leong ML, Bahjat KS, Gao Y, Luckett W,

Liu W, Cook DN, Portnoy DA, Dubensky TW Jr (2004) Listeria-based

cancer vaccines that segregate immunogenicity from toxicity. Proc

Natl Acad Sci USA 101: 13832-13837

54. Meng JZ, Dong YJ, Huang H, Li S, Zhong Y, Liu SL, Wang YD (2010)

Oral Vaccination with Attenuated Salmonella enterica Strains Encoding

T-Cell Epitopes from Tumor Antigen NY-ESO-1 Induces Specific Cy-

totoxic T-Lymphocyte Responses. Clin Vaccine Immunol 17: 889-894

55. Echchannaoui H, Bianchi M, Baud D, Bobst M, Stehle JC, Nardelli-Ha-

efliger D (2008) Intravaginal Immunization of Mice with Recombinant

Salmonella enterica Serovar Typhimurium Expressing Human Papillo-

mavirus Type 16 Antigens as a Potential Route of Vaccination against

Cervical Cancer. Infect Immun 76: 1940-1951

56. Tangney M, van Pijkeren JP, Gahan CG (2010) The use of Listeria mo-

nocytogenes as a DNA delivery vector for cancer gene therapy. Bioen-

gineered Bugs 1: 284-287

57. Zuo SG, Chen Y, Wu ZP, Liu X, Liu C, Zhou YC, Wu CL, Jin CG, Gu

YL, Li J, Chen XQ, Li Y, Wei HP, Li LH, Wang XC (2010) Orally Admi-

nistered DNA Vaccine Delivery by Attenuated Salmonella typhimurium

Targeting Fetal Liver Kinase 1 Inhibits Murine Lewis Lung Carcinoma

Growth and Metastasis. Biol Pharm Bull 33: 174-182

58. Feng K, Zhao H, Chen J, Yao D, Jiang X, Zhou W (2004) Anti-angio-

genesis effect on glioma of attenuated Salmonella typhimurium vaccine

strain with flk-1 gene. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 24:

389-391

59. Miao WM, Seng WL, Duquette M, Lawler P, Laus C, Lawler J (2001)

Thrombospondin-1 type 1 repeat recombinant proteins inhibit tumor

growth through transforming growth factor-b-dependent and -inde-

pendent mechanisms. Cancer Res 61: 7830-7839

60. Lee CH, Wu CL, Shiau AL (2005) Systemic administration of attenu-

ated Salmonella choleraesuis carrying thrombospondin-1 gene leads to

tumor-specific transgene expression, delayed tumor growth and pro-

longed survival in the murine melanoma model. Cancer Gene Ther

12: 175-184

61. Li X, Fu GF, Fan YR, Liu WH, Liu XJ, Wang JJ, Xu GX (2003) Bifidobacte-

rium adolescentis as a delivery system of endostatin for cancer gene the-

rapy: selective inhibitor of angiogenesis and hypoxic tumor growth.

Cancer Gene Ther 10: 105-111

62. Xu YF, Zhu LP, Hu B, Fu GF, Zhang HY, Wang JJ, Xu GX (2007) A

new expression plasmid in Bifidobacterium longum as a delivery system

of endostatin for cancer gene therapy. Cancer Gene Ther 14: 151-157

63. Loeffler M, Krüger JA, Reisfeld RA (2005) Immunostimulatory effects

of low-dose cyclophosphamide are controlled by inducible nitric oxide

synthase. Cancer Res 65: 5027-5030

64. Niethammer AG, Wodrich H, Loeffler M, Lode HN, Emmerich K, Ab-

dollahi A, Krempien R, Debus J, Huber PE, Reisfeld RA (2005) Multi-

drug resistance-1 (MDR-1): a new target for T cell-based immunothe-

rapy. FASEB J 19: 158-159

65. Chavez AR, Buchser W, Basse PH, Liang X, Appleman LJ, Maranchie

JK, Zeh H, de Vera ME, Lotze MT (2009) Pharmacologic administra-

tion of interleukin-2. Ann N Y Acad Sci 1182: 14-27

66. Sorenson BS, Banton KL, Frykman NL, Leonard AS, Saltzman DA

(2008) Attenuated Salmonella typhimurium with interleukin 2 gene pre-

vents the establishment of pulmonary metastases in a model of oste-

osarcoma. J Pediatr Surg 43: 1153-1158

67. Barnett SJ, Soto LJ 3rd, Sorenson BS, Nelson BW, Leonard AS, Salt-

zman DA (2005) Attenuated Salmonella typhimurium invades and de-

creases tumor burden in neuroblastoma. J Pediatr Surg 40: 993-997

68. Sorenson BS, Banton KL, Frykman NL, Leonard AS, Saltzman DA

(2008) Attenuated Salmonella typhimurium with IL-2 gene reduces pul-

monary metastases in murine osteosarcoma: development of a repro-

ducible model. Clin Orthop Relat Res 466: 1285-1291

69. al-Ramadi BK, Fernandez-Cabezudo MJ, El-Hasasna H, Al-Salam S,

Bashir G, Chouaib S (2009) Potent anti-tumor activity of systemical-

ly-administered IL2-expressing Salmonella correlates with decreased

angiogenesis and enhanced tumor apoptosis. Clin Immunol 130: 89-97

70. Barbé S, Van Mellaert L, Theys J, Geukens N, Lammertyn E, Lambin

P, Anné J (2005) Secretory production of biologically active rat inter-

leukin-2 by Clostridium acetobutylicum DSM792 as a tool for anti-tumor

treatment. FEMS Microbiol Lett 246: 67-73

71. Alexandroff AB, Jackson AM, O’Donnell MA, James K (1999) BCG

immunotherapy of bladder cancer: 20 years on. Lancet 353: 1689-1694

72. Xiao Z, Hanel E, Mak A, Moore RB (2011) Antitumor efficacy of intra-

vesical BCG, Gemcitabine, Interferon-α and Interleukin-2 as Mono- or

Combination- Therapy for Bladder Cancer in an Orthotopic Tumor

Model. Clinical Medicine Insights: Oncology 5: 315-323

73. Yoon WS, Choi WC, Sin JI, Park YK (2007) Antitumor therapeutic ef-

fects of Salmonella typhimurium containing Flt3 Ligand expression pla-

smids in melanoma-bearing mouse. Biotechnol Lett 29: 511-516

74. Xiang R, Mizutani N, Luo Y, Chiodoni C, Zhou H, Mizutani M, Ba

Y, Becker JC, Reisfeld RA (2005) A DNA vaccine targeting survivin

combines apoptosis with suppression of angiogenesis in lung tumor

eradication. Cancer Res 65: 553-561