Całkowity potencjał antyoksydacyjny wyznaczony metodą chromatograficzną niektórych ziół i napoi a

background image




Oświadczenie kierującego pracą


Oświadczam, że praca dyplomowa magisterska studentki Joanny Czajki pt. Całkowity

potencjał antyoksydacyjny, wyznaczony metodą chromatograficzną, niektórych ziół i napoi

alkoholowych została przygotowana pod moim kierunkiem, stwierdzam, że spełnia ona warunki

przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie tytułu zawodowego magistra.






Data

podpis kierującego pracą





Oświadczenie autora pracy


Świadoma odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza praca dyplomowa

magisterska pt. Całkowity potencjał antyoksydacyjny, wyznaczony metodą

chromatograficzną, niektórych ziół i napoi alkoholowych została napisana przeze mnie

samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny z obowiązującymi przepisami

(Ustawa z dnia 04.02.2004 r. o prawie autorskim i prawach pokrewnych: Dz. U. z 2006 r. nr 90,

poz. 631 z późniejszymi zmianami).

Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur

związanych z uzyskaniem tytułu zawodowego w szkole wyższej.

Oświadczam ponadto, że niniejsza wersja jest identyczna z załączoną wersją

elektroniczną.




Data

podpis autora pracy


background image

AKADEMIA PODLASKA

______________________________________________


WYDZIAŁ NAUK ŚCISŁYCH

Kierunek chemia






Joanna Czajka



Całkowity potencjał antyoksydacyjny, wyznaczony metodą

chromatograficzną, niektórych ziół i napoi alkoholowych










Praca magisterska napisana

w Katedrze Chemii Organicznej

pod kierunkiem

Prof. dr hab. Bronisława Krzysztofa Głoda




Siedlce, 2007

background image






Total antioxidant potential, obtained using chromatographic assay,

of some herbs and alcoholic beverages






Słowa kluczowe:

- rodnik hydroksylowy

- całkowity potencjał antyoksydacyjny

- wysokosprawna chromatografia cieczowa

- kwas tereftalowy

- detekcja fluorescencyjna























background image












Promotorowi

Panu prof. dr hab. Bronisławowi K. Głodowi

składam serdeczne podziękowania

za podjęcie trudu prowadzenia mojej pracy,

cenne uwagi oraz pomoc i życzliwość podczas

jej wykonywania

background image

Panu mgr Pawłowi Piszczowi

składam podziękowania za wszelką

udzieloną pomoc przy wykonaniu tej pracy




background image

6




______________________________________________

SPIS TREŚCI




SPIS TREŚCI.................................................................................................................................6

1. CZĘŚĆ LITERATUROWA .................................................................................................8

1.1.

Podstawowe informacje o wolnych rodnikach ................................................................8

1.2.

Tlen i produkty jego redukcji...........................................................................................9

1.2.1. Tlen singletowy ...........................................................................................................9

1.2.2. Anionorodnik ponadtlenkowy, O

2

·-

.............................................................................9

1.2.3. Rodnik nadhydroksylowy, HO

2

·

..................................................................................9

1.2.4. Nadtlenek wodoru, H

2

O

2

...........................................................................................10

1.2.5. Rodnik hydroksylowy,

·

OH .......................................................................................10

1.2.6. Tlenek azotu, NO.......................................................................................................10

1.3.

Wpływ wolnych rodników na komórki zwierzęce ..........................................................11

1.3.1. Peroksydacja lipidów.................................................................................................11

1.3.2. Wpływ na aminokwasy i białka.................................................................................11

1.3.3. Wpływ na kwasy nukleinowe....................................................................................11

1.3.4. Działanie wolnych rodników na cały organizm ........................................................12

1.4.

Antyoksydanty, zmiatacze wolnych rodników................................................................12

1.5.

Metody oznaczania wolnych rodników i stresu oksydacyjnego. Całkowity potencjał

antyoksydacyjny.........................................................................................................................13

1.6.

Właściwości naturalnych antyoksydantów ....................................................................16

2. CEL PRACY........................................................................................................................17

3. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA.......................................................................................18

3.1.

Odczynniki .....................................................................................................................18

background image

7

3.2.

Aparatura ......................................................................................................................18

3.3.

Metody pomiarowe ........................................................................................................19

3.3.1. Przygotowywanie próbek ..........................................................................................19

3.3.2. Stosowane antyoksydanty .........................................................................................19

3.3.3. Wytwarzanie rodników i ich reakcja z antyoksydantami..........................................20

3.3.4. Warunki rozdziału chromatograficznego ..................................................................21

4. WYNIKI ...............................................................................................................................22

4.1.

Wpływ stężenia próbki na zmianę powierzchni piku .....................................................22

4.2.

CPA wysokoprocentowych napoi alkoholowych ...........................................................24

4.4.

CPA niskoprocentowych napoi alkoholowych .............................................................25

4.5.

CPA naparów ziołowych ...............................................................................................26

4.6.

CPA soków i napoi bezalkoholowych............................................................................27

4.7.

Porównanie różnych CPA .............................................................................................28

5. DYSKUSJA WYNIKÓW ...................................................................................................29

5.1.

Wpływ stężenia próbki na zmianę powierzchni piku .....................................................29

5.2.

CPA wysokoprocentowych napoi alkoholowych ...........................................................29

5.3.

CPA niskoprocentowych napoi alkoholowych ..............................................................30

5.4.

CPA ziół.........................................................................................................................31

5.5.

CPA soków i napoi ........................................................................................................32

5.6.

Porównanie CPA różnych klas produktów spożywczych ..............................................32

6. WNIOSKI.............................................................................................................................33

7. STRESZCZENIE ................................................................................................................34

8. AKRONIMY I SKRÓTY....................................................................................................35

9. PIŚMIENNICTWO.............................................................................................................36

background image

8




______________________________________________

1. CZĘŚĆ LITERATUROWA



1.1. Podstawowe

informacje o wolnych rodnikach

Tlen jest pierwiastkiem niezbędnym do życia, ale zarazem toksycznym [1, 2]. W

większości zużywany jest w komórkowych procesach energetycznych. Podczas jego redukcji

wytwarzane są reaktywne formy tlenu (ang. ROS – reactive oxygen species), do których zalicza

się wolne rodniki tlenowe, a także tlen singletowy i nadtlenek wodoru.

Wolne rodniki są to atomy, cząsteczki lub ich fragmenty bądź też jony posiadające

conajmniej jeden niesparowany elektron na powłoce walencyjnej, który nadaje im właściwości

paramagnetyczne [3]. Powstawanie ich związane jest z rozrywaniem wiązań w cząsteczkach lub

z przenoszeniem elektronów. Jedną z ważniejszych cech jest ich względnie wysoka reaktywność.

Wolne rodniki mogą być indukowane przez różne czynniki fizykochemiczne, do których

należą: promieniowanie jonizujące, ultrafioletowe, podczerwone i widzialne, a także reakcje

utleniania i redukcji. Głównymi źródłami powstawania jest autooksydacja związków

niskocząsteczkowych, a mianowicie: flawin, tioli, katecholamin, hydrochinonów oraz niektóre

reakcje enzymatyczne, do których zalicza się oksydazę ksantynową, oksydazę cytochromową P-

450 i b-5 systemu mikrosomalnego, dysmutazę ponadtlenkową stymulującą mitochondrialny

system transportu elektronów. Podczas tzw. wybuchu oddechowego rodniki mogą także

generować pobudzone komórki fagocytujące (makrofagi, monocyty i granulocyty) do

zwalczania infekcji [4]. W tym przypadku odgrywają one pozytywną rolę. Mogą wywoływać

jednak działanie kancerogenne przy długotrwałym ich wytwarzaniu (np. w przewlekłych stanach

zapalnych). Za najważniejszy generator wolnych rodników uchodzi mitochondrialny łańcuch

oddechowy [5].

Reaktywne formy tlenu w organizmie wytwarzane są w czasie:

- ekspozycji na wysokie ciśnienie tlenu oraz w czasie reperfuzji poischemicznej,

- działania związków chemicznych np. kancerogennych, pestycydów, antybiotyków

antracyklicznych, barwników azowych, ozonu, dymu papierosowego (nikotyny),

background image

9

- rozrywania

wiązań pod wpływem energii zewnętrznej (np. promieniowanie α, β, γ, UV,

wyładowania elektryczne czy temperatura),

- zaburzeń procesów metabolicznych pojawiających się w wyniku: awitaminozy (brak witamin

A i E), procesów starzenia się organizmów, w stanach zapalnych,

- procesu fagocytozy i fotosyntezy, w reakcjach z udziałem cytochromów (komórki

fagocytujące (makrofagi, monocyty, granulocyty) podczas infekcji wytwarzają jony

ponadtlenkowe, nadtlenek wodoru i rodniki hydroksylowe w celu obrony organizmu),

- przebiegu

reakcji

enzymatycznych,

- procesów metabolicznych zachodzących w mitochondriach i mikrosomach,

- podczas peroksydacji wielonienasyconych kwasów tłuszczowych.

1.2. Tlen i produkty jego redukcji

Najprostszym rodnikiem (dokładnie birodnikiem w stanie trypletowym) jest tlen

atmosferyczny, którym oddychamy. Ma on względnie dużą reaktywność, ale jest ona

stosunkowo mała jak na rodnik.

1.2.1. Tlen singletowy

W stanie wzbudzonym tlen występuje w postaci singletu. Tworzy się m.in. w reakcjach

utleniania anionorodnika ponadtlenkowego żelazem (część reakcji Habera-Weissa) i

oksyalkoholem oraz w czasie nieenzymatycznej dysmutacji nadtlenku (utleniaczem w tej reakcji

jest rodnik nadhydroksylowy będący silnym utleniaczem). Komórkowym źródłem wzbudzonego

tlenu są: nieenzymatyczna peroksydacja lipidów, fagocytoza, reakcje katalizowane przez

peroksydazy.

1.2.2. Anionorodnik ponadtlenkowy, O

2

·-

Pierwszym produktem redukcji tlenu jest anionorodnik ponadtlenkowy (O

2

•-

) i jego

sprotonowana forma – rodnik nadhydroksylowy (HO

2

), który jest znacznie bardziej reaktywny.

Rodnik ponadtlenkowy może być zarówno utleniaczem jak i reduktorem [6]. W

rozpuszczalnikach niepolarnych jest silną zasadą i nukleofilem [7], zaś w roztworach wodnych

działa jak silny czynnik redukujący oddając swój dodatkowy elektron, bądź jako słaby czynnik

utleniający ulegający redukcji do nadtlenku wodoru.

1.2.3. Rodnik nadhydroksylowy, HO

2

·

Rodnik nadhydroksylowy jest znacznie silniejszym utleniaczem niż anionorodnik

ponadtlenkowy. Przypuszcza się nawet [8], że układ rodników O

2

·-

/HO

2

·

odpowiedzialny jest za

background image

szkodliwe działanie tlenu i uszkadzanie błon komórkowych. Charakteryzuje się długim czasem

życia, przez co może dyfundować do sąsiednich struktur komórkowych.

1.2.4. Nadtlenek wodoru, H

2

O

2

Nadtlenek wodoru powstaje w wyniku reakcji dysmutacji. Wytwarzany jest również

przez oksydazę L-aminokwasową i glikolanową. Jest najbardziej stabilną, pośrednią formą

redukcji tlenu do wody. Jako produkt redukcji tlenu cząsteczkowego, nie jest wolnym rodnikiem,

ponieważ nie posiada niesparowanych elektronów. Występuje w chloroplastach, mitochondriach,

siateczce śródplazmatycznej.

1.2.5. Rodnik hydroksylowy,

·

OH

Rodnik hydroksylowy jest wysoce reaktywny, a przez to reaguje tylko z cząsteczkami

znajdującymi się w najbliższym otoczeniu [9]. Wchodzi w reakcje z wieloma związkami

organicznymi (addycja, substytucja wolnorodnikowa, przenoszenie elektronów). Jest mało

ruchliwy, nie penetruje komórki.

Rodnik hydroksylowy powstaje podczas homolizy wiązania w cząsteczce wody pod

wpływem promieniowania jonizującego lub zgodnie z reakcją Fentona, która została opisana po

raz pierwszy w 1884 roku:

(1)

H

O

OH

Fe

O

H

Fe

-

3

2

2

2

+

+

+

+

=

+

Utleniony metal może być następnie zredukowany, co oznacza, że pełni on rolę katalizatora:

(2)

2

+

2

2

+

3

+

=

+

O

Fe

O

Fe

W sumie reakcję Fentona i ponadtlenkową redukcję metalu można przedstawić jako jedną

reakcję Habera-Weissa (1934r.):

(3)

+

+

=

+

OH

OH

O

O

H

O

-

2

2

2

-

2

Bez obecności katalizatora, czyli jonów metali przejściowych, ostatnia reakcja przebiega bardzo

wolno. Dodatek żelaza na plus drugim stopniu utlenienia znacznie ją przyspiesza. Żelazo na plus

trzecim stopniu utlenienia również może ją pośrednio katalizować, gdyż jest łatwo redukowalne

w organizmie.

1.2.6. Tlenek azotu, NO

W

organizmach

żywych tlenek azotu powstaje w procesie utleniania argininy do

cytruliny. Jest on neurotoksyczny, kancerogenny i może wytwarzać inne wolne rodniki. Po

przejściu z przeciwutleniacza do nadtlenoazotynu staje się silnym utleniaczem.

10

background image

11

1.3. Wpływ wolnych rodników na komórki zwierzęce

Wolne rodniki w organizmach żywych atakują przede wszystkim lipidy, białka i materiał

genetyczny. W szczególny sposób narażone są na nie mitochondria i błony komórkowe, gdyż ich

uszkodzenie może doprowadzić do śmierci komórek [10].

1.3.1. Peroksydacja lipidów

Rodniki powstające z tlenu biorą udział w procesie przemiany lipidów. Termin

peroksydacja lipidów oznacza przemiany wywołane wpływem wolnych rodników na lipidy,

skutkiem czego, są różnego rodzaju produkty pośrednie o własnościach utleniających.

Produktami peroksydacji lipidów mogą być aldehydy, ketony czy hydroksynadtlenki, które

oddziaływują nie tylko na składniki komórek ale również na ich błony. Obecność ich wywołuje

zmiany ładunków na powierzchni błony oraz zmiany płynności błon. Dochodzi do pęcznienia,

czyli wzrostu objętości mitochondriów [11].

1.3.2. Wpływ na aminokwasy i białka

Wolne rodniki uszkadzają białka, czego skutkiem jest starzenie się komórki. Skóra staje

się sucha, stara i zwiotczała. Mięśnie słabną i tracą swoją sprężystość.

Podobne procesy

zachodzą wewnątrz organizmu, ale skutki są o wiele gorsze. Starzeje się cały organizm,

ponieważ starzeją się wszystkie komórki, których białko jest zaatakowane przez rodniki.

Efekty uszkodzeń struktury białek pod wpływem wolnych rodników można rozpatrywać

w trzech aspektach:

- modyfikacji

aminokwasów,

- fragmentacji

białek,

- agregacji

i

sprzęgania krzyżowego fragmentów peptydowych (powstawanie bityrozyny i

cystyny).

1.3.3. Wpływ na kwasy nukleinowe

Wolne rodniki oddziaływując z kwasami nukleinowymi mogą doprowadzić do

rozerwania łańcuchów lub modyfikacji zasad purynowych i pirymidynowych. Za powstawanie

tych uszkodzeń odpowiada w głównej mierze rodnik hydroksylowy, będący najsilniejszym

czynnikiem utleniającym w komórce, który z łatwością powoduje modyfikację cząsteczki kwasu

nukleinowego (modyfikacja zasad heterocyklicznych, rozrywanie wiązań fosfodiestrowych,

rozerwanie wiązań glikozydowych oraz uszkodzenie reszt pentozowych).

background image

12

1.3.4. Działanie wolnych rodników na cały organizm

Wolne rodniki spełniają dużo korzystnych funkcji w organizmie. Są używane przez ciała

odpornościowe do niszczenia bakterii chorobotwórczych, utleniają substancje toksyczne. Tlenek

azotu i rodniki hydroksylowe wykorzystywane są w terapii nowotworów.

Z drugiej strony wolne rodniki uszkadzają DNA czyli kod genetyczny komórki. Prowadzi

to do powstawania komórek nowotworowych. Wywołują także wiele innych schorzeń, do

których można zaliczyć miażdżycę, chorobę Parkinsona, Alzheimera, raka itp.

W szczególny sposób na uszkodzenia wolnorodnikowe jest narażony mózg. Występują w

nim w dużych ilościach wielonienasycone kwasy tłuszczowe i żelazo, zaś w niewielkich

antyutleniacze.

1.4. Antyoksydanty, zmiatacze wolnych rodników

Organizmy

żywe (w tym człowiek) rozwinęły skomplikowany system obronny,

zabezpieczający przed szkodliwym działaniem wolnych rodników tlenowych, określany

systemem zmiataczy wolnych rodników tlenowych lub antyoksydacyjnym. Można je podzielić na

antyutleniacze enzymatyczne lub nieenzymatyczne [9].

1. Antyutleniacze enzymatyczne

a) System oksydaz mitochondrialnych,

b) Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) – wyróżnia się trzy rodzaje tego enzymu:

SOD1 (Cu,Zn-SOD) oraz SOD-2 i SOD-3 (obie zawierające Mn). Występuje w

zarówno w mitochondriach jak i cytozolu. Katalizuje dysmutację anionorodnika

ponadtlenkowego do nadtlenku wodoru, powodując spadek jego stężenia.

c) Peroksydaza glutationowa – w swoim składzie zawiera atom selenu, z tego

względu jest on błędnie uważany za antyutleniacz. Występuje w cytozolu i

mitochondriach. Redukuje hydronadtlenki organiczne i nadtlenek wodoru do

tlenu cząsteczkowego i wody.

d) Katalaza – jest reaktywna w peroksyzomach, obniża stężenie nadtlenku wodoru.

Okazało się, że osłabienie funkcji SOD i katalazy prowadzi do szybkiego

starzenia się komórek.

e) Ceruloplazmina – miedzioproteina o niebieskiej barwie występująca w surowicy

krwi. Katalizuje ona utlenianie jonów żelaza, przez co zapobiega wytwarzaniu

rodników hydroksylowych, likwiduje anionorodnik ponadtlenkowy [9]. Jest

enzymem zewnątrzkomórkowym o działaniu podobnym do SOD.

background image

13

2. Antyutleniacze nieenzymatyczne

a) Witamina E i beta-karoten – najsilniejszym fizjologicznym antyoksydantem,

działającym w błonach komórkowych oraz lipoproteinach osocza jest witamina E.

Za główną biologiczną rolę witaminy E uważa się redukcję wolnych rodników

oraz zapobieganie peroksydacji nienasyconych kwasów tłuszczowych. Witamina

E i beta-karoten chronią płuca przed dymem tytoniowym, ponieważ usuwają NO

2

˙

[10].

b) Witamina C (kwas askorbinowy) – jest reduktorem zaangażowanym w reakcje

hydroksylacji (tworzenie hydroksyproliny w kolagenie), chelatuje metale, w tym

żelazo oraz chroni witaminy A i E przed utlenianiem. Reaguje z wolnymi

rodnikami w cytoplazmie i zewnątrzkomórkowo. Reagując z rodnikiem

hydroksylowym, ponadtlenkowym i tlenem singletowym, utrzymuje potencjał

oksydoredukcyjny komórek.

c) Kwas moczowy – jest inhibitorem peroksydacji lipidów, wchodzi w reakcje z

oksydantami, jak również wiąże jony żelaza. Jest końcowym produktem

metabolizmu puryn.

d) Chelatory metali (transferyna, mioglobina, laktoferyna, hemoglobina) – ich

mechanizm działania polega na zapobieganiu katalizowania reakcji utleniania

przez żelazo i miedź. Można do nich zaliczyć też poliaminy biogenne.

e) Glutation – jest jednym z głównych niskocząsteczkowych czynników obrony

przed działaniem wolnych rodników tlenowych. Występuje w wysokich

stężeniach we wszystkich komórkach eukariotycznych.

f) Koenzym Q

10

(ubichinon) – występuje w cytoplazmie w połączeniu z

lipoproteinami oraz w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, w mitochondrialnym

układzie oddychania. Zapobiega przed utlenianiem lipidów.

g) Fito-związki – zmiatacze rodników o pochodzeniu roślinnym (flawonoidy,

antocyjany, proantocyjany, pytoestrogeny, polifenole) posiadające właściwości

antyoksydacyjne [12].

1.5. Metody oznaczania wolnych rodników i stresu oksydacyjnego. Całkowity

potencjał antyoksydacyjny

W literaturze opisanych jest wiele metod oznaczania zarówno wolnych rodników [13-20]

jak i antyoksydantów [13, 20-23]. W organizmach żywych zachodzi wiele przemian, w wyniku

których dochodzi do wytworzenia wolnych rodników o różnej trwałości i reaktywności. Istnieje

background image

14

więc potrzeba oznaczania sumarycznej ilości tych rodników lub stresu oksydacyjnego, który

wywołują [18, 24-27]. Stężenia antyoksydantów zmieniają się podczas powstawania zmian

patologicznych, które są spowodowane z jednej strony ich zużywaniem się podczas reakcji z

wolnymi rodnikami, z drugiej zaś akcją obronną organizmu. Często oznaczanie sumarycznego

stężenia wszystkich antyoksydantów pozwala na lepszą ocenę poziomu mocy antyoksydacyjnej

badanego układu, niż oznaczanie stężenia poszczególnych antyoksydantów każdego z osobna

[28-37].

Wolne rodniki w swej budowie zawierają niesparowane elektrony, co nadaje im

właściwości paramagnetyczne. Dlatego też pomiar oddziaływania próbki z polem

magnetycznym dostarcza informacji o sumarycznej ilości wolnych rodników w niej zawartych.

Taki pomiar można wykonać przy użyciu wagi tzw. aparatu Gouy’a [38, 39]. Na oznaczaniu

własności paramagnetycznych próbki oparte są również pomiary elektronowego rezonansu

paramagnetycznego (EPR).

Rodniki mogą być także wytwarzane pod wpływem działania na niektóre związki

promieniowania elektromagnetycznego. W przypadku odwrotnej reakcji, np. rekombinacji

rodników lipidowych dochodzi wówczas do wydzielenia kwantu promieniowania

elektromagnetycznego tzn. chemiluminescencji. Metoda pomiaru chemiluminescencji pozwala

na badanie niestabilnych rodników lipidowych, możliwych nawet w do bezpośredniej analizy

żywym organizmie [40].

Z chemicznego punktu widzenia wolne rodniki są, z reguły, utleniaczami, z kolei

antyoksydanty są reduktorami. Dlatego możliwe jest ich oznaczanie (w tym, ich sumarycznego

stężenia i całkowitego potencjału antyoksydacyjnego) metodami elektrochemicznymi [43].

Oznaczanie stresu oksydacyjnego jest również możliwe za pomocą analizy niektórych

związków naturalnie występujących w komórkach. Do tej grupy zalicza się oznaczanie

sumarycznego stężenia tioli [44, 45], stosunek stężeń glutationu do jego postaci utlenionej [46,

47] jak również kwasu askorbinowego do dehydroaskorbinowego [48]. Rodniki wchodzą w

reakcje prawie ze wszystkimi związkami aktywnymi biologicznie. Do wyznaczenia stopnia

uszkodzenia związków służą produkty reakcji.

Inna metoda polega na dodaniu do badanego układu związku, który tworzy trwały

rodnik, możliwy do

oznaczeń przy pomocy dowolnej metody analitycznej, np. elektronowego

rezonansu paramagnetycznego bądź fotometrii [41, 42].

Stężenie rodników hydroksylowych, które są najbardziej reaktywne spośród wszystkich

rodników, jest przybliżoną miarą całkowitego stresu oksydacyjnego. Ponieważ rodniki te

wyjątkowo nietrwałe do ich oznaczania stosuje się metodę pułapki spinowej. Oznaczanie tą

metodą polega na wprowadzeniu względnie nietoksycznych związków aromatycznych do

materiału biologicznego, a następnie oznaczeniu produktów ich reakcji z rodnikiem

background image

15

hydroksylowym. Jako pułapkę spinową stosuje się naturalnie występująca fenyloalaninę, kwas

tereftalowy [45] lub egzogenne pochodne aspiryny [2, 15]. Oznaczanie produktów odbywa się

głównie na drodze chromatograficznej.

W literaturze można odnaleźć następujące określenia na sumaryczne stężenie wszystkich

antyoksydantów w badanym układzie: TRAP – total redox antioxidant potential, TRAP – total

peroxyl radical trapping antioxidant parametr, FRAP – ferric reducing ability of plasma, ORAC

oxygen radical absorbance capacity, TEAC – Trolox-equivalent antioxidant capacity, TAC –

total antioxidant capacity oraz TAR – total antioxidant reactivity [29, 34]. W tej pracy będę

stosowała termin całkowity potencjał antyoksydacyjny, w skrócie CPA.

Pomiar CPA znacznie się rozwinął w odniesieniu do badania zdolności

antyoksydacyjnych skomplikowanych próbek biologicznych (surowica czy osocze krwi) [29-37].

Jedna z metod, FRAP, opiera się na redukcji żelaza przez składniki surowicy oraz na

fotometrycznym pomiarze wytworzonych trwałych rodników [32, 44].

Inna metoda, tzw. TRAP, polega na badaniu rodników peroksylowych, które powstają

wskutek termicznego rozpadu związków diazowych. Monitoruje się je za pomocą detektora,

czyli takiego związku, który w wyniku reakcji z rodnikiem będzie zmieniał swoje właściwości

fizykochemiczne, łatwe do oznaczania. Efekt ten można zaobserwować poprzez zmianę sygnału

luminescencyjnego [33], fluorymetrycznego [29, 51] lub fotometrycznego [31, 35]. Miarą

potencjału antyoksydacyjnego jest przesunięcie w czasie krzywej obrazującej zmiany stężenia

detektora lub produktu jego reakcji, w czasie. Przesunięcie to jest spowodowane tym, że zawarte

w próbce antyoksydanty nie dopuszczają do reakcji detektora z rodnikiem. Warunkiem tej

metody jest, aby reakcja próbki z rodnikiem była znacznie szybsza od analogicznej reakcji

detektora.

Do pomiaru CPA mogą być również zastosowane metody chromatograficzne. Układ

pomiarowy zawiera wtedy próbkę biologiczną bądź badany związek oraz detektor (np. kwas p-

hydroksybenzoesowy) [52] pełniący rolę pułapki spinowej. Rodniki hydroksylowe generowane

są w reakcji analogicznej do reakcji Fentona [49, 50]. Są one zmiatane przez detektor jak i przez

badaną próbkę. W przypadku, gdy próbka charakteryzuje się większą reaktywnością z rodnikami

niż detektor, wówczas nastąpi zmniejszenie wysokości piku chromatograficznego produktu

reakcji detektora z rodnikiem. Można w ten sposób porównać moc zmiatania rodników

hydroksylowych przez różne próbki. Zmniejszenie to jest zależne od mocy jak i stężenia

antyoksydanta (Rys. 1).

background image

odniesienie

próbka

czas

st

ęż

enie

OH

Rys.1. Schemat pomiaru całkowitego potencjału antyoksydacyjnego metodą chromatograficzną.

1.6. Właściwości naturalnych antyoksydantów


W ostatnich latach duże zainteresowanie wzbudzają naturalne antyoksydanty zawarte w

roślinach. Należą do nich polifenole, a w szczególności flawonoidy i antocyjany. Związki te,

występujące w wielu owocach, warzywach, herbacie i ziołach, wykazują silne właściwości

antyoksydacyjne [57]. Szczególnie dużo antocyjanów zawartych jest w aronii czarnej (Aronia

melanocarpa) [57, 58], bzie czarnym (Sambucus nigra) czy korze sosny śródziemnomorskiej

(Pinus pinaster). Żółte i czerwone zabarwienie kwiatów pochodzi często od flawonoidów, z

kolei czerwono-fioletowe barwy jagód od antocyjanów.

16

background image

17

2. CEL PRACY




W literaturze opisane są metody oznaczania rodników hydroksylowych z zastosowaniem

fenyloalaniny, kwasu salicylowego, a także kwasu p-hydroksybenzoesowego, jako pułapek

spinowych. Produkty reakcji tych związków z rodnikami oznaczane były za pomocą HPLC z

detekcją elektrochemiczną. Te same związki były zastosowane do oznaczania CPA (w tym

przypadku rodniki hydroksylowe były generowane w układzie pomiarowym). Ostatnio okazało

się, że do oznaczania rodników hydroksylowych można zastosować kwas tereftalowy.

Produktem reakcji był wówczas kwas hydroksytereftalowy oznaczany za pomocą HPLC z

detekcją fluorescencyjną [53, 54].

Celem pracy było:

- zbadanie

możliwości zastosowania kwasu tereftalowego do oznaczania CPA (z

zastosowaniem detekcji fluorescencyjnej),

- zbadanie

właściwości antyoksydacyjnych napoi alkoholowych i bezalkoholowych,

naparów herbat i ziół oraz soków.













background image

18







______________________________________________

3. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA


3.1. Odczynniki


Podczas pracy stosowałam następujące odczynniki:

-

kwas tereftalowy (TFA); Sigma-Aldrich, Niemcy,

-

bufor fosforanowy w soli fizjologicznej PBS (Phosphate Buffered Saline) w

tabletkach; Sigma-Aldrich, Niemcy,

- siarczan

(VI)

żelaza (II); Sigma-Aldrich, Niemcy,

-

fosforan sodowy jednozasadowy cz.d.a.; POCh, Polska,

-

fosforan potasowy dwuzasadowy cz.d.a.; POCh, Polska,

-

wodorotlenek sodu cz.d.a., Chempur, Polska,

-

3% woda utleniona; Infarm, Polska,

-

alkohol etylowy; POCh, Polska.

Próbki napoi alkoholowych, herbat, ziół i soków zostały zakupione w najbliższym

supermarkecie. W pracy stosowałam wodę destylowaną.

3.2. Aparatura


Pomiary chromatograficzne były wykonywane za pomocą zestawu do wysokosprawnej

chromatografii cieczowej (HPLC) firmy Knauer (Niemcy) składającego się z:

- pompy

dwutłokowej Smartline 1000 o zakresie przepływu 0,001-50 ml/min,

- interfejsu

z

degazerem, Smartline Manager 500,

-

dozownika o objętości pętli 20 μl,

- mieszalnika,

-

kolumny analitycznej RP-18 5μm, 250x3 mm śred. wew., Hypersil, Wielka

Brytania,

-

termostatu Smartline 400 o zakresie temperatur 5-85° C,

-

detektora DAD UV-Vis Smartline 2600 do oznaczania TFA,

background image

19

- detektora fluorescencyjnego RF-10AXL do oznaczania kwasu

hydroksytereftalowego (HTFA), Schimadzu, Japonia,

- komputera.

pH buforu było mierzone pehametrem CP – 251 (Elmetron, Polska) kalibrowanym przed

każdym pomiarem dwoma roztworami wzorcowymi o pH 7,0 i 4,0.

3.3. Metody pomiarowe

3.3.1. Przygotowywanie próbek

Substancje użyte do analizy nie były wstępnie oczyszczane. Roztwory przygotowywane

były poprzez rozpuszczenie naważek w wodzie destylowanej. Przechowywane były one w

lodówce do jednego tygodnia. Stężenia wyjściowe związków do reakcji wynosiły 10 mM.

3.3.2. Stosowane antyoksydanty

Podczas pracy badałam CPA napoi alkoholowych, naparów herbat i ziół oraz napoi i

soków. Napoje alkoholowe zostały podzielone na dwie grupy, tj. wysokoprocentowe napoje

alkoholowe (wódki, likiery, brandy itp.) i niskoprocentowe napoje alkoholowe (wina, piwa,

wermuty itp.).

Wysokoprocentowe napoje alkoholowe (około 40%):

- wódka

Borovicka (Słowacja),

- whisky

Ballantines (Irlandia),

- brandy

Grand Cavalier (Łotwa),

- nalewka

Czarny Balsam (Łotwa),

- nalewka

Unicum (Węgry),

- likier

Krupnik (Polska),

- likier

Bylinna (Czechy),

- likier

Malibu (Polska),

- gin

Gordon’s (Wielka Brytania).

Wszystkie były rozcieńczane wodą destylowaną 20-krotnie.

Niskoprocentowe napoje alkoholowe (około 5-15%):

Wśród nich wyróżniamy piwo Grafen Walder Strong (Niemcy), a także wina:

białe: półwytrawne Blanc de Blanc (Bułgaria), wytrawne Chardonnay (Węgry),

różowe: półwytrawne Melnik Rose (Bułgaria), gazowane Spurmante Roso

(Włochy),

background image

20

czerwone: słodkie Pierre Chalain (Francja), słodkie Commandaria (Cypr),

półsłodkie Pamid ((Bułgaria), półsłodkie Kadarka (Bułgaria), słodkie

Kadarka (Mołdawia), wytrawne Bordeaux (Francja), wermut Martini

(Włochy).

Wszystkie były rozcieńczane 10-krotnie wodą destylowaną.

Napary

ziół i herbat (biała, zielona, czerwona, czarna, żeńszeniowa i kawa żołędziowa)

przygotowane były poprzez rozpuszczenie naważki 1g, a następnie parzone przez 15 minut w 10

ml gotującej się wody destylowanej. Następnie były sączone przez sączek membranowy

(Milipore, USA).

Napoje i soki: Gingers beer (Polska), karob (Cypr), ocet winny (Włochy), sok z czarnego

bzu (Polska) czy sok z brzozy (Polska) były przed badaniami rozcieńczane 10-krotnie wodą

destylowaną.

3.3.3. Wytwarzanie rodników i ich reakcja z antyoksydantami

Układ pomiarowy zawierał próbkę (roztwór napoju alkoholowego lub naparu z herbaty)

oraz detektor (kwas tereftalowy), który pełnił rolę pułapki spinowej. Rodniki hydroksylowe były

generowane w reakcji Fentona w obecności żelaza na plus drugim stopniu utlenienia, buforu

fosforanowego i nadtlenku wodoru

Fe

2+

+ H

2

O

2

= Fe

3+

+ OH

-

+ OH

·

.

Zarówno detektor (Rys. 2) jak i badana próbka zmiatały wygenerowane w ten sposób rodniki. W

przypadku, kiedy próbka odznaczała się większą reaktywnością z rodnikami niż detektor

wysokość piku chromatograficznego produktu reakcji detektora z rodnikiem

(kwasu hydroksyl-

tereftalowego) była mniejsza niż układu bez próbki. Wynikiem pomiaru była więc różnica pola

powierzchni przed i po dodaniu próbki. Reakcję przeprowadzano poprzez dodanie do naczynka

roztworów:

- 500

μl buforu fosforanowego pH = 7,4, o stężeniu c = 0,02 M,

- 100

μl 10 mM TFA,

- 100

μl 0,3% H

2

O

2,

- wody

destylowana,

-

próbki (sumaryczna objętość próbki i wody destylowanej wynosiła 200 µl),

- 100

μl 10 mM FeSO

4.

Fe (II) dodawane było na samym końcu, ponieważ inicjowało ono reakcję. Po jego dodaniu

mierzony był czas 7 minut, po którym otrzymany roztwór był wstrzykiwany na kolumnę. Czas

ten wyznaczony był eksperymentalnie z pomiarów koleżanki Katarzyny Czajki, która prowadziła

równolegle badania w ramach swojej pracy magisterskiej.

background image

TFA +

OH = HTFA

COOH

COOH

+

OH

COOH

COOH

OH

Rys. 2. Reakcja pułapkowania rodnika hydroksylowego kwasem tereftalowym, w wyniku której

powstaje kwas hydroksytereftalowy.

3.3.4. Warunki rozdziału chromatograficznego

Warunki chromatograficznego oznaczania kwasu hydroksytereftalowego (HTFA) zostały

wyznaczone eksperymentalnie. Pomiary przeprowadzane były w temperaturze 18°C, w układzie

faz odwróconych przy przepływie fazy ruchomej 0,7 ml/min. Fazą ruchomą był bufor

fosforanowy o pH 6,6. Przed rozpoczęciem pracy kolumna była stabilizowana fazą ruchomą

przez pół godziny. Za pomocą strzykawki wprowadzana była do dozownika próbka o objętości

powyżej 20 μl, która następnie trafiała na kolumnę. Sygnał wyjściowy detektora

fluorescencyjnego pracującego przy długości fali wzbudzenia 312 nm i fali emisji 428 nm był

monitorowany w sposób ciągły przez komputer. Każda próbka była badana trzykrotnie, a

wynikiem ostatecznym była średnia z tych pomiarów. Dla każdej średniej obliczone zostało

odchylenie standardowe (SD), które zaznaczono na wykresach.

Bufor fosforanowy o pH 6,6, stosowany jako faza ruchoma przygotowany, był przez

zmieszanie 312,5 ml 0,2 M NaH

2

PO

4

i 187,5 ml 0,2 M K

2

HPO

4

. Całość dopełniano wodą

destylowaną do 1 litra. pH buforu mierzone było za pomocą pehametru. Ewentualne różnice w

żądanym pH były korygowane dodatkiem jednego z roztworów składowych.

W pracy przetestowane zostały dwa sposoby wyrażania miary CPA. Pierwszym była

różnica pola powierzchni piku HTFA otrzymanego bez próbki w mieszaninie reakcyjnej i pola w

obecności próbki o stężeniu końcowym wynoszącym dla wysokoprocentowych napoi

alkoholowych 200 µl/l, niskoprocentowych napoi alkoholowych, soków i napoi

bezalkoholowych 500 µl/l oraz naparów herbat 0,5 g/l. Drugą miarą CPA było nachylenie

zależności różnic podanych pól powierzchni od stężenia próbki. Gdy próbka zbyt silnie zmiatała

rodniki hydroksylowe wówczas CPA nie zależało od jej stężenia. W takich przypadkach

stosowane były bardziej rozcieńczone roztwory, a wyniki były przeliczane na podane stężenia,

zakładając liniową zależność CPA od stężenia dla małych jego wartości.

21

background image




4. WYNIKI

4.1. Wpływ stężenia próbki na zmianę powierzchni piku

0

20

40

60

80

0

2000

4000

6000

c [

μl/l]

zm

ia

n

a

pol

a pow

ie

rz

ch

ni

pi

ku

[μ

V*

m

in

]

Rys. 3. Wpływ stężenia wina czerwonego Pierre Chalain na zmianę pola powierzchni piku

HTFA. Warunki chromatograficzne: kolumna RP-18 - Hypersil 5 μm, 250x3 śred. wew.,

temperatura 18° C, szybkość przepływu 0,7 ml/min, detektor fluorescencyjny o długość fali

wzbudzenia λ=312nm, emisji λ=428nm, faza ruchoma 100% bufor fosforanowy o pH=6,6 i

stężeniu 0,1 M.

22

background image

0

10

20

30

40

50

60

70

0

500

1000

1500

2000

2500

c [

μl/l]

zm

ia

na

po

la

pow

ie

rz

c

hni

pi

k

u

[μ

V*

m

in

]

Rys. 4. Wpływ stężenia

wina różowego Spurmante Roso na zmianę pola powierzchni piku HTFA.

Warunki chromatograficzne jak na Rys. 3.

y = 0,1259x
R

2

= 0,9554

0

10

20

30

40

50

60

0

100

200

300

400

500

c [

μl/l]

zm

ia

na

pol

a

pow

ie

rz

c

hni

pi

k

u

[μ

V*

m

in]

Rys. 5. Wpływ stężenia 40% roztworu alkoholu etylowego na zmianę pola powierzchni piku

HTFA. Warunki chromatograficzne jak na Rys. 3.

czy to był to czysty alkohol?

23

background image

4.2. CPA wysokoprocentowych napoi alkoholowych

0

20

40

60

80

100

120

0

100

200

300

400

500

c [

μl/l]

zm

ia

na

po

la

po

w

ie

rz

c

hn

i p

ik

u

[μ

V*

m

in

]

Czarny Balsam

Unicum

Bylinna

Ballantines

Borovicka

Grand Cavalier

Rys. 6.

Wpływ stężenia wysokoprocentowych napoi alkoholowych na zmianę pola powierzchni

piku HTFA. Warunki chromatograficzne jak na Rys. 3.

0

10

20

30

40

50

60

Gr

an

d Ca

va

lie

r

Go

rd

on

's

Kr

up

nik

Bo

ro

vi

ck

a

M

al

ibu

Ba

lla

nt

in

es

By

linn

a

Et

an

ol

Un

ic

um

Cz

ar

ny

B

als

am

CP

A [

μ

V*

m

in

]

Rys. 7. Wartości CPA wysokoprocentowych napoi alkoholowych o stężeniu 200 µl/l. Warunki

chromatograficzne jak na Rys. 3.

24

background image

4.4. CPA niskoprocentowych napoi alkoholowych

0

10

20

30

40

50

60

70

0

200

400

600

800

1000

1200

c [

μl/l]

zm

ia

na

pol

a

pow

ie

rz

c

hni

pi

k

u

[μ

V

*mi

n

]

Martini

Melnik Rose

Blanc de Blanc

Grafen Walder Strong

Rys. 8. Wpływ stężenia niskoprocentowych napoi alkoholowych na zmianę pola powierzchni piku

HTFA. Warunki chromatograficzne jak na Rys. 3.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Gr

afe

n Wa

ld

er

St

ro

ng

Ch

ard

on

nay

Bla

nc

d

e

Bl

an

c

Pi

err

e C

ha

la

in

Pa

mi

d

Me

ln

ik

Ro

se

Sp

ur

m

ant

e Ro

so

Ka

da

rk

a M

Ka

da

rk

a B

Co

m

ma

nd

ar

ia

Bo

rd

eau

x

Ma

rti

ni

CPA [

μ

V

*mi

n

]

Rys. 9. Wartości CPA niskoprocentowych napoi alkoholowych o stężeniu 500 μl/l. Warunki

chromatograficzne jak na Rys. 3.

25

background image

4.5. CPA naparów ziołowych


0

10

20

30

40

50

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

c [g/l]

zm

ia

na

pol

a

pow

ie

rz

c

hni

pi

k

u

[μ

V*

m

in]

Zielona chińska

Biała

Czarna

Żeńszeniowa

Rys. 10. Wpływ stężenia herbat na zmianę pola powierzchni piku HTFA. Warunki

chromatograficzne jak na Rys. 3.

0

10

20

30

In

dia

ek

sp

re

so

wa

Pu

-E

rh

c

hi

ńs

ka w

ni

ow

a

Że

ńs

ze

ni

ow

a

M

ar

oc

co

e

ksp

re

sow

a

Ea

rl G

re

y e

ksp

re

so

wa

Cz

erw

on

a

Ka

w

a

żo

łę

dz

io

wa

Zie

lo

na

mi

ęt

ow

a

Cz

ar

na

Bi

a

Zi

el

ona

c

hi

ńsk

a

CP

A [

μ

V*

m

in

]

Rys. 11. CPA naparów ziołowych o stężeniu 0,5 g/l. Warunki chromatograficzne jak na Rys. 3.



26

background image




0

10

20

30

40

50

60

In

di

a ek

spr

es

owa

Pu

-Er

h c

hi

ńs

ka

wi

śni

ow

a

Cze

rwo

na

Że

ńs

zen

io

wa

Ma

roc

co e

ks

pr

es

ow

a

Ea

rl G

rey

e

ksp

re

sow

a

Zi

elo

na m

to

wa

Ka

wa

żo

łę

dz

io

wa

Cz

ar

na

Bia

ła

Zi

elo

na c

hi

ńs

ka

CP

A [

μ

V*

m

in

*l

/μ

g]


Rys. 12. CPA, wyrażone jako nachylenia krzywej…, naparów ziołowych o stężeniu 0,5 g/l.

Warunki chromatograficzne jak na Rys. 3. Czy jednostki są ok.?


4.6. CPA soków i napoi bezalkoholowych

0

10

20

30

40

50

0

200

400

600

800

1000

1200

c [

μl/l]

zm

ia

na

pol

a

pow

ie

rz

c

hni

pi

k

u [

μ

V*

m

in]

Karob

Sok z brzozy

Ocet winny

Gingers beer

Rys. 13. Wpływ stężenia soków i napoi bezalkoholowych na zmianę pola powierzchni piku

HTFA. Warunki chromatograficzne jak na Rys. 3.

27

background image


0

4

8

12

16

20

24

Gingers

beer

Ocet winny

Sok z

brzozy

Sok z

czarnego

bzu

Karob

CP

A [

μ

v*m

in

]

Rys. 14. Wartości CPA dla soków i napoi o stężeniu 500 µl/l. Warunki chromatograficzne jak na

rys. 3.

4.7. Porównanie

różnych CPA

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Oc

et

wi

nn

y

Bl

anc

d

e

Bl

an

c

He

rb

. cz

arn

a

Ka

ro

b

Sp

urm

an

te

R

os

o

He

rb

. b

ia

ła

He

rb

. z

ie

lo

na

c

hi

ńsk

a

Et

an

ol

Ma

rti

ni

Uni

cum

Cza

rn

y

Ba

ls

am

CP

A [

μ

V*

m

in

]

Rys. 15. Porównanie wartości CPA różnych próbek. Warunki chromatograficzne jak na

rys. 3. Nie można porównywać wielkości o różnych mianach. Można porównywać tylko próbki o

tym samym stężeniu.

28

background image

29

5. DYSKUSJA

WYNIKÓW



5.1. Wpływ stężenia próbki na zmianę powierzchni piku

Na Rys. 3 i 4 przedstawiłam zależności zmiany pola powierzchni piku HTFA od stężenia

dla dwóch wybranych zmiataczy rodników hydroksylowych (podobne wykresy uzyskałam dla

wszystkich badanych próbek). Wynika z nich, że stężenie dodawanej próbki na początku ma

istotny wpływ na zmianę powierzchni piku. W pewnym zakresie zależność ta jest liniowa,

następnie ulega zakrzywieniu i przyjmuje praktycznie stałą wartość. Oznacza to, że przy dużym

stężeniu próbki wszystkie wygenerowane rodniki z nią przereagowują. Uzyskana na krzywej

kalibracyjnej asymptota oznacza brak piku chromatograficznego HTFA na chromatogramie.

Zarówno z powyższych rysunków, jak i z Rys. 5, 6, 8, 10 i 13, wynika, że w małym zakresie

stężeń powyższe krzywe kalibracyjne są liniowe. W celu porównywania różnych próbek

pracowałam w zakresie liniowym, co jest przedstawione na wykresach.

5.2. CPA wysokoprocentowych napoi alkoholowych

Wartości całkowitego potencjału antyoksydacyjnego wysokoprocentowych napoi

alkoholowych przedstawione zostały na Rys. 7. Okazało się, że najsilniejszymi własnościami

antyoksydacyjnymi charakteryzowała się Łotewska nalewka Czarny Balsam (podać oryginalną

nazwę). Drugim z kolei był Węgierski Unicum, a następnie Bylinna, Ballantines, Malibu,

Borovicka, Krupnik, Gordon’s oraz Grand Cavalier. W celu odróżnienia udziału w CPA udziału

antyoksydantów (głównie polifenoli) od etanolu w pracy przebadałam także CPA samego

etanolu (Rys. 5). Okazało się, że jest on zmiataczem wolnych rodników (Rys. 7). Wprawdzie

napoje alkoholowe o najsilniejszych własnościach antyoksydacyjnych (Czarny Balsam, Unicum)

charakteryzowały się znacznie większymi wartościami CPA niż czysty alkohol etylowy o tym

samym stężeniu, tym nie mniej istnieje wyraźna korelacja między stężeniem etanolu, a CPA.

Wynik ten nie będzie zaskakujący, jeśli zdamy sobie sprawę z tego, że stężenie poszczególnych

background image

30

antyoksydantów jest na poziomie od ppb do ppm, podczas gdy stężenie etanolu waha się w

granicach 25-45%. Należy w tym miejscu zaznaczyć, że nadmiar etanolu w organizmie

człowieka prowadzi do wzrostu stężenia wolnych rodników [

60

], co jest spowodowane jego

autooksydacją do aldehydu octowego. Z drugiej strony z badań tych wynika, że często

składnikiem wielu ekstraktów ziołowych jest właśnie etanol.

5.3. CPA niskoprocentowych napoi alkoholowych

Współcześnie, w świetle badań dotyczących związku między trybem życia i spożyciem

wina, a wskaźnikiem umieralności, znamienna zdaje się być teoria o nieocenionym wpływie

tego, jak się odżywiamy i jaki prowadzimy tryb życia.

Korzyści płynące z picia szklanki

czerwonego wina dziennie zostały odkryte w minionej dekadzie kiedy zaczęto się zastanawiać

nad tzw. "francuskim paradoksem" - mimo wysokocholesterolowej diety Francuzi mieli niski

wskaźnik zachorowalności na choroby układu krążenia. Badania wykazywały, że związane jest

to ze spożywaniem przez nich właśnie czerwonego wina w codziennej diecie [55].

Niezwykłe właściwości wina są spowodowane obecnością składników

przeciwutleniających, a głównie polifenoli, w tym flawonoidów, w tym antocyjanów, a także

resweratrolu. Posiadają one zdolność niszczenia wolnych rodników, które to, jak już

wspomniałam, przyspieszają proces starzenia się organizmu czy też wpływają na powstawanie

różnych chorób. Związki polifenolowe stanowią dużą grupę związków szeroko

rozpowszechnionych wśród roślin. Występują w wielu warzywach, owocach, herbacie,

czekoladzie, a także w dużych ilościach w skórce winogron. Polifenole z wina wykazują silne

działanie antyoksydacyjne. Hamują utlenianie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych [56],

wiążą jony żelaza i miedzi, co przeszkadza powstawaniu wolnych rodników. Stężenie polifenoli

w winach zależy od jego rodzaju. W czerwonym winie znajduje się znacznie więcej tych

związków niż w winie białym. Spowodowane to jest nie tylko gatunkiem winorośli, ale także

różnymi procesami wyrobu. Czerwone wino powstaje jako produkt fermentacji całych owoców,

zaś wino białe z fermentacji soku. Za zabarwienie czerwonego wina odpowiadają antocyjany i

resweratrol. Spożywanie czerwonego wina w umiarkowanych ilościach może być skutecznym

zabiegiem wspomagającym w zapobieganiu chorobie wieńcowej serca.

Badanie całkowitego potencjału antyoksydacyjnego niskoprocentowych napoi

alkoholowych potwierdziło, że wina czerwone są najlepszymi zmiataczami rodników

hydroksylowych. Z kolei najsłabszym zmiataczem okazało się piwo Grafen Walder Strong,

mające niską zawartość alkoholu. Ponownie okazało się, że CPA jest skorelowane ze stężeniem

etanolu w próbce. Wina białe mają dużo niższą moc zmiatania rodników

OH w stosunku do win

czerwonych i różowych. Najwyższymi wartościami CPA charakteryzował się wermut, wino

background image

31

zawierające w swym składzie ekstrakt z piołunu oraz inne przyprawy ziołowo-korzenne tj.

szałwię, goździki, kolendrę i gałkę muszkatołową.

5.4. CPA ziół

W ostatnich

latach obserwuje się wzrost zainteresowania naturalnymi antyoksydantami,

zwłaszcza barwnikami roślinnymi – flawonoidami. Najczęściej występują one jako żółte

barwniki rozpuszczone w soku komórkowym w kwiatach, liściach, rzadziej w owocach, korze

czy drewnie. Do grupy flawonoidów zalicza się m.in. flawony, flawanony, antocyjany,

flawonole i flawonony. Związki te, występujące w wielu herbatach i ziołach, są silnymi

antyutleniaczami [57]. Prozdrowotne właściwości herbaty są znane już od ponad czterech

tysięcy lat. Zapoczątkowane zostało przez cesarza Chin Szen Nung któremu, według legendy,

wpadł do wody listek herbaty. W Europie zdrowotne jej działanie poznano około XVI wieku.

Wśród herbat wyróżniamy białą, zieloną, czerwoną i czarną. Każdą z nich charakteryzuje

odmienny sposób przetwarzania.

Herbata biała i zielona należą do herbat niepoddanych procesowi fermentacji. Herbata

biała powstaje z młodych pąków liści, które jeszcze nie zdążyły się rozwinąć. Poddaje się je

tylko procesowi więdnięcia i suszenia, nie praży się ich ani nie zwija. Z kolei świeżo zebrane

liście herbaty zielonej pozostawia się do przeschnięcia i poddaje obróbce cieplnej co

powstrzymuje fermentację. Dzięki zastosowaniu takiej obróbki liście zachowują zielony kolor, a

także cenne właściwości lecznicze.

Herbata czerwona (pu-erh) przechodzi dodatkowy proces fermentacji i leżakowania. Jej

charakterystyczną cechą jest bardzo silny zapach i smak. Czarną herbatę otrzymuje się w wyniku

czterech procesów: więdnięcia, skręcania, fermentacji i suszenia.

CPA różnych ziół, w tym wspomnianych herbat, przedstawione zostały na Rys. 11.

Okazało się, że rodniki hydroksylowe najsilniej są zmiatane przez napar herbaty zielonej. Jej

najsilniejsze właściwości antyoksydacyjne wynikają z obecności związków z grupy

flawonoidów w niej występujących. Słabszymi zmiataczami rodników hydroksylowych okazały

się napary herbaty białej i czarnej, jak również z kawy żołędziowej, która została zaliczona do

ziół. Najsłabszymi własnościami antyoksydacyjnymi wyróżniają się napary z herbat

ekspresowych i herbaty żeńszeniowej.

Miarą CPA w moich pomiarach była różnica pola powierzchni piku HTFA bez obecności

próbki oraz przy jej dodatku. W przypadku naparów ziołowych przetestowałam możliwość

zastosowania nachylenia krzywej zależności zmiany powierzchni piku HTFA, bez i z próbką, od

stężenia próbki (Rys. 12). Okazało się, że w obu przypadkach (Rys. 11 i 12) otrzymałam

analogiczne względne wartości, co wynika zresztą z własności zależności liniowej.

background image

32

Z danych literaturowych wiadomo, że ekstrakty ziołowe, w tym zielona herbata, aronia i

imbir były badane metodą

fluorymetryczną [59]. Wynika z nich, że napar z zielonej herbaty jest

najsilniejszym antyoksydantem w stosunku do rodników hydroksylowych, peroksylowych i

nadtlenoazotynu. Spowodowane jest to wysokim stężeniem flawonoidów w niej występujących.

Badania te potwierdziły się również przy zastosowaniu detekcji fluorescencyjnej w stosunku do

rodników hydroksylowych.

5.5. CPA soków i napoi

Kolejnymi próbkami jakie przebadałam były soki i napoje (Rys. 14). Wśród nich na

szczególną uwagę zasługuje karob, który ma największy CPA spośród badanych substancji.

Karob inaczej zwany szarańczynem strąkowym występuje w regionie śródziemnomorskim.

Rozwijające się strąki karobu (zwane chlebem Świętojańskim) wyglądem przypominają zielone,

lecz bardzo szerokie strąki fasoli, dojrzewając stają się ciemnobrązowe. Zarówno nasiona jak i

strąki są jadalne. Karob w smaku przypomina osłodzone kakao, dlatego też jest używany jako

jego substytut, głównie ze względu na bardzo niską zawartość tłuszczu, hipoalergiczność i brak

kofeiny.

Mające niższe CPA, ale równie dobrze zmiatające rodniki hydroksylowe są soki z

czarnego bzu i brzozy. W dalszej kolejności występuje ocet winny, zaś na samym końcu napój

korzenny Gingers beer.

5.6. Porównanie CPA różnych klas produktów spożywczych

Rys. 15 przedstawia zestawienie niektórych związków spośród przebadanych i ich wpływ

na CPA. Najwyższa wartość potencjału przypada dla wysokoprocentowego napoju

alkoholowego Czarny Balsam, później Unicum. Następnym mocnym zmiataczem rodników

hydroksylowych jest czerwony wermut Martini, napary z herbat i karob. Najsłabsze właściwości

antyoksydacyjne ma wino białe i ocet winny.

background image

33

______________________________________________

6. WNIOSKI


1.

Kwas tereftalowy może być użyty do oznaczania całkowitego potencjału

antyoksydacyjnego z zastosowaniem HPLC z detekcją fluorescencyjną.

2.

Zaletą metody, w stosunku do metod opisanych w literaturze jest jej odniesienie do

rodnika hydroksylowego. Ponieważ jest to najbardziej reaktywny rodnik, dlatego wydaje

się sensowne, aby właśnie w stosunku do niego wykonywać pomiary CPA. Porównanie

wartości CPA mierzonych w stosunku do różnych rodników pozwala na zbadanie

selektywności działania poszczególnych antyoksydantów.

3.

Niektóre napoje alkoholowe mają silne właściwości antyoksydacyjne, zależne m.in. od

stężenia alkoholu etylowego.

4. Spośród zbadanych ziół najsilniejszymi własnościami antyoksydacyjnymi

charakteryzował się napar z zielonej herbaty. Prawdopodobnie spowodowane jest to tym,

że herbata czerwona i czarna tracą część antyoksydantów (flawonoidów) podczas procesu

obróbki (fermentacji).

background image

34

______________________________________________

7. STRESZCZENIE

W pracy badano całkowity potencjał antyoksydacyjny (CPA) metodą chromatograficzną

z zastosowaniem kwasu tereftalowego jako detektora i detekcji fluorescencyjnej. Rodniki

hydroksylowe generowane były w reakcji Fentona w obecności żelaza na plus drugim stopniu

utlenienia, buforu fosforanowego i nadtlenku wodoru. Pomiary CPA wykonano na próbkach

napoi alkoholowych i bezalkoholowych, soków, naparów herbat i ziół w odpowiednich

stężeniach. Zarówno detektor jak i badana próbka zmiatały wygenerowane rodniki

hydroksylowe. W przypadku kiedy próbka odznaczała się większą reaktywnością z rodnikami,

powodowało to zmniejszenie wysokości piku chromatograficznego produktu reakcji detektora z

rodnikiem. Całkowity potencjał antyoksydacyjny wyznaczany był z różnicy pola powierzchni

piku pochodzącego od kwasu hydroksytereftalowego (HTFA) bez próbki i pola powierzchni

piku z zastosowaną próbką.

background image

35

8.

AKRONIMY I SKRÓTY



CPA

Całkowity Potencjał Antyoksydacyjny

DAD

matryca fotodiodowa

DNA

kwas dezoksyrybonukleinowy

FRAP

Ferric Reducing Ability of Plasma

HPLC

wysokosprawna chromatografia cieczowa (High Performance Liquid

Chromatography)

HTFA

kwas hydroksytereftalowy (hydroxytereftalic acid)

ORAC

Oxygen Radical Absorbance Capacity

PBS

bufor fosforanowy (phosphate buffered saline)

pHBA

kwas p-hydroksybenzoesowy

ROS

reaktywne formy tlenu (Reactive Oxygen Species)

SD

odchylenie standardowe

SOD

dysmutaza ponadtlenkowa (Super Oxide Dysmutase)

TAC

Total Antioxidant Capacity

TAR

Total Antioxidant Reactivity

TEAC

Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity

TFA

kwas tereftalowy (tereftalic acid)

TRAP

Total Peroxyl Radical Trapping Antioxidant Parameter

TRAP

Total Redox Antioxidant Potential

UV

promieniowanie ultrafioletowe

Wolne rodniki i reaktywne formy tlenu

O

2

·-

anionorodnik ponadtlenkowy

HO

·

rodnik hydroksylowy

HO

2

·

rodnik nadhydroksylowy

H

2

O

2

nadtlenek wodoru (woda utleniona)

NO

tlenek azotu

background image

36

9. PIŚMIENNICTWO


1.

Richards D.A., J.Chromatogr., 175(1979)293.

2.

Głód B.K., Czapski G.A., Haddad P.R., TrAC, Trends Anal. Chem., 19(2000)492.

4.

Slater T.F., J. Biochem. 222(1984)1.

5.

Babior B.M., J. Clin. Invest., 73(1984)599.

6.

Boveris A., Oshino N., Chance B.,

Biochem. J., 128(1972)617.

7.

Bielski B.H.J., Photochem. Photobiol., 28(1978)645.

8.

Purrington S.T., Kenion G.B., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 120(1982)732.

9.

Fridovich I., Arch. Biochem. Biophys., 247(1986)1.

10.

Bartosz G., Druga Twarz Tlenu, PWN, Warszawa 2003.

11.

Głód B.K., Strosznajder J., Wolne rodniki w starzeniu się mózgu i innych procesach

biologicznych, w Mózg a starzenie (Mossakowski M.J., Strosznajder J., red.), Oświata

UN-O, Warszawa 2001.

12.

Sohal R.S., Mitochondria and Free Radicals in Neurodegenerative Diseases, Beal M.F.

Howell N., Bodis-Wollner I., red., Willey-Liss Inc., 1997.

13.

Rice-Evans C.A., Miller N.J., Paganga G., Free Rad. Biol. Med. 7(1996)933.

14.

Osborne P.G., Yamamoto K., J. Chromatogr. B., 707(1998)3.

15.

Halliwell B., Kaur H., Ingelman-Sundeberg M., Free Radical Biol. Med., 10(1991)439.

16.

Głód B.K., Neurochem. Res.,22(1997)1237.

17.

Głód B.K., Czapski G.A.,Haddad P.R., TRAC, Trends Anal. Chem., 19(2000)492.

18.

Glód B.K., Grieb P., Chem. Anal. (Warsaw), 47(2002)399.

19.

Rehman A., Whiteman M., Halliwell B., British J. Pharmacol., 122(1997)1702.

20.

Ellis A., Adatia I., Yazdanpanah M., Makela S.K., Clin. Biochem., 31(1998)195.

21.

Lin T-K. and Lai C-C., J. Chromatogr., 227(1982)369.

22.

Głód B.K., Hilgier W., Strosznajder J., Albrecht J., Chem. Anal.(Warsaw), 45(2000)27.

23.

Abuja P.M., Albertini R., Clin. Chim. Acta, 306(2001)1.

24.

Ghiselli A., Serafini M., Maiani G., Azzini E., Ferro-Luzzi A., Free Rad. Biol. Med.,

18(1995)29.

25.

Carlberg M., J. Neurosci. Meth., 52(1994)165.

background image

37

26.

Kostner K., Bayai S., Jansen M., Khoschsorur G., Horl W.H., Maurer G., Winklhofer-

Roob B., Derfler K., Clin. Chim. Acta, 288(1999)21.

27.

Waterfall A.H., Singh G., Fry J.R., Marsden C. A., Neurosci. Lett., 200(1995)69.

28.

Acworth I.N., Bailey B., The Handbook of Oxidative Metabolism, ESA Inc. 1995.

29.

Rice-Evans C.A., Free Rad. Res., 33(2000)59.

30.

Valkonen M., Kuusi T., J. Lipid Res., 38(1997)823.

31.

Miller N.J., Rice-Evans C., Davies M.J., Gopinathan V., Milner A., Clin. Scie.,

84(1993)407.

32.

Lissi E., Salim-Hanna M., Pascual C., del Castillo M.D., Free Rad. Biol. Med.,

18(1995)153.

33.

Ghiselli A., Serafini M., Natella F., Saccini C., Free Rad. Biol. Med., 29(2000)1106.

34.

Tubaro F., Ghiselli A., Rapuzzi P., Maiorino M., Ursini F., Free Rad. Biol. Med.,

24(1998)1228.

35.

Krasowska A., Rosiak D., Szkapiak K., Łukasiewicz M., Curr. Topics Biophys.,

24(2000)89.

36.

Wang H., Joseph J.A., Free Rad.Biol. Med., 27(1999)612.

37.

Genser D., Kang M-H., Vogelsang H., Elmadta I., Europ. J. Clin. Nutrit., 53(1999)676.

38.

Tsai E.C., Hirsh I.B., Brunzel J.D., Chait A., Diabetes, 43(1994)1010.

39.

Głód B.K., Kowalski C., Pol. J. Food Nutrit. Sci., (2004)2328.

40.

Kowalski C., Głód B.K., Wolne rodniki i antyoksydanty: Ich rola w funkcjonowaniu

organizmu, metody oznaczania oraz występowanie w ziołach: [w] Immunomodulacja:

nowe możliwości w ochronie zdrowia, Siwicki K., Skopińska-Różewska E., Świderski F.,

red., Edycja, Warszawa 2004, str. 63-74.

41.

Aspen A., Lissi E.A., J. Protein Chem., 20(2001)479.

42.

Tarpey M.M., Fridovich I., Circ. Res., 89(2001)224.

43.

Chevion S., Berry E. M., Kitrossky N., Kohen R., Free Rad. Biol. Med., 22(1997)411.

44.

Kohen R., Vellaichamy E., Hrbac J., Gati I., Tirosh O., Free Rad. Biol. Med.,

28(2000)547.

45.

Bald E., w The XXVI

th

Sci. Symp. “Chromatogr. Med. Invest. Org. Comp.”, Katowice-

Szczyrk 5-6.06.2002.

46.

O’Gara C., Maddipati K., Marnett L., Chem. Res. Toxicol., 2(1989)295.

47.

Asensi M., Sastre J., Pallardo F.V., Lloret A., Lehnor M., Asuction J.G., Met. Enzymol.,

295(1999)267.

48.

Miltor K.P., Dzialosynski T., Sanford S.E., Trevithicle J.R., Curr. Eye Res.,

16(1997)564.

49.

Diplock A.T., Free Rad. Res., 33(2000)521.

background image

38

50.

Floyd R.A., Watson J.J., Wong P.K., J. Biochem. Biophys. Meth. 10(1984)221.

51.

Tabner B.J., Turnbull S., El-Agnaf O.M.A., Allsop D., Free Rad. Biol. Med.,

32(2002)1076.

52.

Niki E., Saito M., Yoshikawa Y., Yamamoto Y., Kamiya Y., Bull. Chem. Soc. Jpn.,

59(1986)471.

53.

Ste-Marie El., Boismenu D., Vachon L., Montogomary J., Anal. Biochem. , 241(1996)67.

54.

Barreto J.C., Smith G.S., Strobel N.H.P., McQuillin P.A., Miller T.A., Pharmac. Letters,

56(1995)90.

55.

Linxiang L., Abe Y., Nagasawa Y., Kudo R., Usui N., Imai K., Mashino T., Mochizuki

M., Miyata N., Biomed. Chromatogr., 2004.

56.

Sun AY., Symonyi A., Sun G.Y., Free Rad. Biol. Med., 32(2002)314.

57.

Helpern M.J., Dahlgren A.L., Laakso I., J. Int. Med. Res., 26(1998)171.

58.

Tsuda T., Horio F., Osawa T., BioFactors, 13(2000)133.

59.

Xu H.X., Lee S.F., Phytoter. Res., 15(2001)39.

60.

Głód B.K., Konior A., Tłuszcze jadalne, t.41, nr 3-4, (2006)282.

61.

Novitskiy G., Traore K., Wang L., Trush M.A., Mezey E., Alcohol Clin. Exp. Res.,

30(2006)1429.


Document Outline


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Całkowity potencjał antyoksydacyjny wyznaczony metodą chromatograficzną niektórych ziół i napoi alko
Na czym polega metoda chromatografii bibułowej, kosmetologia, chemia kosmetyczna
Oznaczanie składu metodami chromatografii gazowej 1
Identyfikacja cukrów metodą chromatografii bibułowej
4) Odsalanie roztworu białka metodą chromatografii sita molekularnego
OKRE LENIE POTENCJA U ANTYOKSYDACYJNEGO
Analiza gazów energetycznych metodą chromatografii gazowej
Ćw. 5 Rozdział metodą chromatografii bibułowej - sprawozdanie, Chemia ogólna i nieorganiczna
Oznaczanie składu metodami chromatografii gazowej, AKADEMIA GÓRNICZO - HUTNICZA
Odsalanie roztworu białka metoda chromatografii sita molekularnego
29. Wyznaczanie współczynnika podziału Nernsta metodą potencjometryczną, chemia fizyczna
29 Wyznaczanie współczynnika podziału Nernsta metodą potenc

więcej podobnych podstron