Sprawozdanie
Temat: Odsalanie roztworu białka metoda chromatografii sita molekularnego
(0,25% r-r białka w 10m M KNO3)
Cel ćwiczenia:
Poznanie praktyczne chromatograficznej metody sita molekularnego w oparciu o ich różnice w masach cząsteczkowych metodą sączenia na żelu Sephadex.
Zasada metody:
Badaną mieszaninę rozdziela się na kolumnie z sefadeksu. Cząstki o dużej masie cząsteczkowej nie wnikają w mikropory więc szybko przemieszczają się przez wolne przestrzenie miedzy granulkami i wędrują w dół kolumny wraz z czołem rozpuszczalnika. Cząsteczki mniejsze (mniejsze od wielkości porów) wnikają do wnętrza porów i ich prędkość migracji jest znacznie mniejsza. Im cząsteczka mniejsza tym głębiej będzie penetrować pory granulek, tym wolniej będzie migrować przez złoże i tym później pojawi się ona w eluacie od cząsteczki większej od niej.
Obserwacje:
|
Próbka |
Wartość absorbancji przy oznaczaniu ilości białka w roztworze nanoszonym we frakcjach wycieku z kolumny. |
Wartość absorbancji przy wykrywaniu jonu azotanowego we frakcjach wycieku z kolumny. |
|
1 |
0,209 |
|
|
2 |
0,284 |
|
|
3 |
0,202 |
|
|
4 |
0,172 |
|
|
5 |
0,141 |
0 |
|
6 |
0,115 |
0,576 |
|
7 |
0,094 |
0,020 |
|
8 |
0,110 |
0,029 |
|
9 |
0,082 |
0,039 |
|
10 |
0,081 |
0,041 |
|
11 |
0,074 |
0,030 |
|
12 |
|
0,049 |
|
13 |
|
0,049 |
|
14 |
|
0,063 |
|
15 |
|
0,048 |
|
16 |
|
0,051 |
|
17 |
|
0,052 |
|
18 |
|
0,068 |
|
19 |
|
0,122 |
|
20 |
|
0,101 |
|
Suma |
1,564 |
1,338 |
|
Absorbancja przy oznaczaniu zawartości białka w roztworze nanoszonym na kolumnę |
|
B1= 0,098 |
|
B2= 0,094 |
|
Bśr= 0,096 |
a. Ilość białka naniesionego na kolumnę
|
Absorbancja I |
Absorbancja II |
Średnia absorbancja |
Ilość białka (w µg) odczytana z krzywej wzorcowej dla średniej absorbancji |
|
0,098 |
0,094 |
0,096 |
10 |
Ilość białka w 0,5 ml roztworu pobranego do oznaczenia – 10 µg.
Ilość białka w 50 ml roztworu (w kolbce) – 1000 µg.
Do kolbki, przed dopełnieniem wodą do kreski, odpipetowano 1 ml roztworu nanoszonego na kolumnę. Ilość białka w kolbce przed rozcieńczeniem (w 1 ml) i po rozcieńczeniu wodą (w 50 ml) jest taka sama, zmienia się tylko stężenie roztworu. Stąd ilość białka w 1 ml roztworu nanoszonego na kolumnę równa jest 1000 µg.
b. Ilość białka w wycieku z kolumny (odzyskanego z kolumny)
|
Absorbancja |
Ilość w µg |
|
0,209 |
19,9 |
|
0,284 |
27,9 |
|
0,202 |
19,7 |
|
0,172 |
17,1 |
|
0,141 |
13,6 |
|
0,115 |
10,6 |
|
0,094 |
9,8 |
|
0,110 |
10,8 |
|
0,082 |
7,9 |
|
0,081 |
7,9 |
|
0,074 |
7,2 |
Zsumowane odczytane dla poszczególnych frakcji µg białka = 152,4µg.
Ilość białka odzyskanego z kolumny = 1524 µg.
Procent odzyskanego białka w stosunku do naniesionego na kolumnę.
1000 µg. - 100%
1524 µg – x%
x= 152,4%
Objętość zerowa (Vo) złoża w kolumnie, na podstawie objętości potrzebnej do wyeluowania maksymalnego stężenia białka.
Początkowo zebrano 7 ml wycieku z kolumny.
Próbka w której jest najwyższe stężenie białka – próbka 2 = 2ml
Vo = 7 ml + 2 ml
Vo = 9 ml.
e. Objętość eluacyjna dla jonów azotanowych, na podstawie eluatu, w której jony azotanowe osiągają maksymalne stężenie.
Początkowo zebrano 7 ml wycieku z kolumny.
Próbka w której jest najwyższe stężenie jonów azotanowych – próbka 6 = 6ml
Objętość eluacyjna dla jonów azotanowych = 7 ml + 6 ml.
Objętość eluacyjna dla jonów azotanowych = 13 ml.
Wnioski:
Na wykresie obserwujemy dwa piki (przy probówce 2 i 6) co potwierdza założenia teoretyczne że cząstki o dużej masie cząsteczkowej (białka) pierwsze opuszczają żel. Następnie rejestrujemy obecność małych cząstek jonów azotanowych.