OZNACZANIE BIAŁKA
Metoda biuretowa
Zasada:
Reakcja biuretowa jest charakterystyczna dla wiązań peptydowych występujących
w cząsteczkach białek i peptydów (zbudowanych co najmniej z trzech reszt
α - aminokwasów).
W środowisku zasadowym następuje tautomeryzacja (przegrupowanie atomów) wiązań peptydowych -CO-NH- z wytworzeniem formy enolowej:
Z ugrupowaniami tego typu jony miedzi Cu2+ tworzą dwa wiązania kowalencyjne
z atomami tlenu grup enolowych i cztery wiązania koordynacyjne z atomami azotu. Powstaje połączenie kompleksowe o zabarwieniu fiołkowoniebieskim.
Intensywność zabarwienia zależy od liczby wiązań peptydowych zawartych
w cząsteczce badanej substancji. Peptydy dają raczej zabarwienie czerwone, natomiast białka - intensywnie fioletowe. Powyższa zależność wykorzystywana jest do ilościowego oznaczania zawartości białka w roztworach metodą kolorymetryczną.
Odczynniki:
roztwór albuminy o stężeniu 10 mg/cm3 ,
odczynnik biuretowy (1,5 g CuSO4 ·5H2O, 6,9 g winianu sodowo-potasowego, 300 cm3 10% NaOH-uzupełnić wodą dest. Do 1000 cm3).
Wykonanie:
Przygotować sześć czystych, suchych probówek i oznaczyć je kolejno od 0-5. W probówkach sporządzić po 1 cm3 roztworu wzorcowego albuminy wg tabelki . Następnie do wszystkich probówek wprowadzić po 4 cm3 odczynnika biuretowego, wytrząsnąć i pozostawić na 30 minut. Po tym czasie odczytać absorbancję przy 540 nm wobec próbki kontrolnej.
Nr probówki |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
wzorzec albuminy w cm3 |
|
|
|
|
|
|
woda w cm3 |
|
|
|
|
|
|
stężenie albuminy w mg/cm3 |
0 |
2,5 |
5 |
7,5 |
10 |
? |
absorbancja |
|
|
|
|
|
|
Wykreślić krzywą wzorcową metoda najmniejszych kwadratów i odczytać z niej stężenie albuminy w badanej próbce.