Metodyka pracy z bakteriofagami

Bakteriofagi - pasożyty wewnątrzkomórkowe bakterii

stadia:

→

wirion – ma morfologię, ale nie wykazuje metabolizmu, potrafi tylko

infekować

→

fag wegetatywny – nie ma morfologii, nie możemy stwierdzić jego

obecności; forma replikacyjna, dopiero uwolniony nowopowstały fag znowu ma
morfologię

Kształty:

→

sferyczny – „kijanka” z ogonkiem; dwudziestościan

→

postać nitkowata

Kapsyd (płaszcz)

nadaje kształt, zbudowany z białek

w środku upakowany kwas nukleinowy DNA lub RNA,

jedno- lub dwuniciowy

kształt „kijanki”:
np. fag T4

na ogonku pajęcze nóżki + płytka (do adsorbowania na

powierzchni komórki)

fag λ

niekurczliwy ogonek + główka

fag T4

kurczliwy ogonek + główka

Poszczególne fagi mają różne liczby genów, np. fag T4 ma ok. 160 genów
Najwięcej jest genów kodujących syntezę białek

umożliwiających

wydostanie się z komórki i budujących kapsyd

Jedyny cel faga to adsorbowanie się na powierzchni bakterii. Jest to możliwe
tylko przy obecności u bakterii odpowiednich receptorów (np. lipoproteiny,
lipopolisacharydu ) w ścianie komórkowej, otoczce lub w pilusach płciowych
(w przypadku fagów męskich, atakujących komórki z plazmidem F, np. fag
M13)

Etapy zakażenia:
I adsorpcja
 odnalezienie receptora, zaadsorbowanie się na komórce bakteryjnej
Fag T4 adsorbuje się dzięki płytce
Fag λ – końcem ogonka (receptorem jest białko LamB – poryna uczestnicząca w
transporcie maltozy)

II wstrzyknięcie materiału genetycznego
Płaszcz pozostaje na zewnątrz

Po wniknięciu mogą zajść dwa cykle:

a.

lityczny

po wprowadzeniu kwasu nukleinowego
 synteza tzw. wczesnych białek, które inicjują replikację DNA fagowego
przy użyciu aparatu replikacyjnego bakterii
 synteza cząstek kwasu nukleinowego faga
 inicjacja syntezy białek późnych, tj. budujących kapsyd
 pakowanie kwasu nukleinowego do kapsydu
produkcja lizozymu, który od zewnątrz rozpuszcza wiązania glikozydowe
w mureinie, co powoduje osłabienie struktury ściany komórkowej i rozpad
komórki

b.

lizogenny

po wprowadzeniu kwasu nukleinowego
 synteza represora replikacji genomu fagowego (zamiast wczesnych
białek), co hamuje powstawanie nowych cząstek fagowych
 materiał genetyczny wbudowuje się w genom bakterii;
wbudowany genom podlega tym samym procesom co genom bakterii

Fag λ – istnieje ściśle określone miejsce w genomie bakteryjnym, gdzie fag
może się wbudować (pomiędzy genami gal i bio, kodującymi galaktozę i
biotynę); E. coli (λ)

→

oznaczenie zainfekowania fagiem λ; fag w formie

profaga, co oznacza, że póki występuje represor nie jest groźny dla komórki

 szczep lizogenny: komórki zainfekowane profagiem są oporne na
zakażenie kolejnym takim samym lub podobnym fagiem

→

oporne na

superinfekcję; cecha ta często wykorzystywana jest w wirusologii
 uzjadliwienie genomu bakteryjnego razem z fragmentem chromosomu
bakterii; fag λ wycinany jest z fragmentem genu gal lub bio
Uwolnione cząstki zawierają cechy komórki bakteryjnej
Transdukcja – przenoszenie przez fagi cech chromosomalnych do innych
komórek
Wycinanie przez zastosowanie promieniowania UV lub wysokiej
temperatury
Transdukcja zachodzi spontanicznie, gdy podczas podziału komórki zachodzi
nierównomierny rozdział represora replikacji kwasu nukleinowego faga, tak
że tylko jedna komórka potomna dostaje represor, druga zaś ulegfa lizie

T4

→

z jednego faga wnikającego, w obrębie jednej komórki powstaje ok. 200

nowych fagów

M13

→

tylko 8 genów, w tym 7 genów zachodzących

bardzo oszczędny

materiał
 maturaza

→

białko „omnibusowe” (wieloczynnościowe); odpowiada za

adsorpcję, wprowadzenie DNA, replikację, dojrzewanie i uwalnianie
 wnika do wierzchołków pilusów płciowych (inne fagi mogą też wnikać z
boku pilusa); pilusy są drożne, przez nie kwas nukleinowy wnika do środka
komórki
 po zainfekowaniu jednym fagiem M13 może powstać do tysiąca cząstek
fagowych
 cykl nie prowadzi do lizy, dziurawi tylko komórkę, wychodzi z niej porcjami,
co pozwala komórce przeżyć

Efekt działania faga w cyklu litycznym

→

obserwujemy na podłożu stałym

wykonanym metodą płytek dwuwarstwowych;
 mętna, gęsta i nieprzejrzysta murawa, przerywana klarownymi miejscami,
tzw. łysinkami fagowymi, w których zaszła liza komórek
Łysianka powstaje wokół centrum infekcyjnego, tj. jednej komórki zarażonej
fagiem, która zakaża sąsiadujące komórki, prowadząc do ich lizy. Po kilku
cyklach powstaje widoczna gołym okiem, klarowna łysinka.

Jeśli komórka przeżywa w wyniku przeprowadzania przez faga cyklu
lizogennego

→

może nastąpić wolny wzrost i miejscowe rozrzedzenia mętnej

murawy, nie ma jednak klarownych łysinek.

We wcześniej przeprowadzanych doświadczeniach mogliśmy gołym okiem
zaobserwować wzrost kolonii pochodzącej od jednej komórki bakteryjnej.
Pracując z bakteriofagami możemy obserwować efekt działania jednej cząstki
fagowej.
Aby mieć pewność, że jedna komórka bakteryjna będzie zainfekowana nie
więcej niż jednym fagiem, musimy dodać duży nadmiar materiału bakteryjnego
i zainfekowany materiał hodować równomiernie rozprowadzony na podłożu
stałym
 możliwe dzięki metodzie płytek dwuwarstwowych

Fagi wirulentne

liza

Fagi łagodne

10 % komórek nie ulega lizie, przeżywa infekcję fagową

Jeśli mówimy o bakterii, że jest wrażliwa na danego faga, to znaczy, że posiada
odpowiedni receptor.