40
Ćwiczenie 2
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ
IZOLOWANIE I
IDENTYFIKOWANIE
WYBRANYCH
BARWNIKÓW
ROŚLINNYCH
ĆWICZENIE 2
40
Ćwiczenie 2
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ
IZOLOWANIE I
IDENTYFIKOWANIE
WYBRANYCH
BARWNIKÓW
ROŚLINNYCH
ĆWICZENIE 2
41
Ćwiczenie 2
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ
2. IZOLOWANIE I IDENTYFIKOWANIE WYBRANYCH ZWĄZKÓW
POCHODZENIA NATURALNEGO
2.1. Podstawy teoretyczne
A. Lipidy
Omawiane w tym ćwiczeniu barwniki należą do lipidów prenylowych. Lipidy to klasa
związków organicznych charakteryzująca się dużym zróżnicowaniem strukturalnym.
Wśród nich wyróżniamy:
Woski są estrami kwasów tłuszczowych i alkoholi monohydroksylowych o długich
łańcuchach węglowych (Rysunek 1).
O
O
12
27
Rysunek 1
Acyloglicerole to estry gliceryny i kwasów tłuszczowych. Triacyloglicerole zawierają 3
reszty kwasów tłuszczowych (Rysunek 2). Stanowią one najbardziej wydajny
zapasowy materiał energetyczny.
Rysunek 2
Naturalne kwasy tłuszczowe zbudowane są z długich, prostych łańcuchów
węglowodorowych, zawierających najczęściej od 10 do 20 atomów węgla
w cząsteczce. Zazwyczaj liczba atomów węgla jest parzysta.
Glicerofosfolipidy są zbudowane z glicerolu, którego dwie grupy OH tworzą estrowe
wiązania z kwasami tłuszczowymi, natomiast trzecia grupa OH jest zestryfikowana
kwasem ortofosforowym. Taką budowę ma najprostszy związek tej grupy – kwas
fosfatydowy (Rysunek 3). Pochodne kwasu fosfatydowego zawierają dołączone
O
O
R
O
R
O
O
R
O
1
2
3
Triacyloglicerol
42
Ćwiczenie 2
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ
estrowo
do
reszty
fosforanowej
alkohole
takie
jak
cholina
w lecytynie, czy seryna lub etanoloamina w kefalinach. Glicerofosfolipidy wchodzą w
skład wszystkich błon komórkowych. Spotyka się je także w znacznej ilości w
osłonkach mielinowych włókien nerwowych i otoczkach krwinek.
Rysunek 3
Gliceroglikolipidy Jest to grupa lipidów, które obok glicerolu i kwasów tłuszczowych
zawierają składnik cukrowy przyłączony do trzeciej grupy OH glicerolu (Rysunek 4).
Lipidy te są podstawowymi składnikami błon plastydów.
Rysunek 4
O
O
R
O
P
O
R
O
O
O
O
O
O
R
O
P
O
R
O
O
O
O
NH
3
O
O
O
O
R
O
P
O
R
O
O
O
O
NMe
3
1
2
anion fosfatydowy
1
2
fosfatydyloseryna
+
1
2
+
fosfatydylocholina (lecytyna)
43
Ćwiczenie 2
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ
Sfingolipidy Związki, w których reszta kwasu tłuszczowego połączona jest wiązaniem
amidowym z długołańcuchowym aminoalkoholem – sfingozyną (Rysunek 5). Związki
te noszą nazwę ceramidów.
Rysunek 5
Glikosfingolipidy zawierają oprócz kwasu tłuszczowego i sfingozyny resztę cukrową
(Rysunek 6). Należą tu cerebrozydy (z łac. cerebrum – mózg) i gangliozydy – lipidy
występujące w dużych ilościach w błonach komórek nerwowych mózgu.
Rysunek 6
Fosfosfingolipidy są to fosfolipidy, w których do sfingozyny, połączonej wiązaniem
amidowym z resztą kwasu tłuszczowego (ceramid), dołączona jest reszta kwasu
ortofosforowego dodatkowo zestryfikowana drobnocząsteczkowym związkiem
o charakterze alkoholu (seryna, etanoloamina, cholina) (Rysunek 7). Związki
zawierające cholinę nazywane są sfingomielinami, gdyż występują głównie
w osłonkach mielinowych nerwów.
N
H
OH
O
R
OH
9
ceramid (N-acylosfingozyna)
44
Ćwiczenie 2
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ
Rysunek 7
Lipidy prenylowe (zwane także izoprenoidowymi lub terpenoidowymi), których
szkielety powstają przez dołączanie pięciowęglowych reszt izoprenylowych
(2-metylobuta-1,3-dienowych).
Monoterpeny i seskwiterpeny (C10 i C15)
Do tej grupy związków zalicza się głównie olejki eteryczne (Rysunek 8). Spotykane się
je w kwiatach, liściach, owocach, nasionach, korze, a nawet drewnie niektórych roślin.
Są lotne, mają swoisty zapach. Należą do nich między innymi: mentol występujący w
liściach mięty, karwon (w nasionach kminku), cytronelol i geraniol (w kwiatach róży i
bodziszka), pinen (w drewnie oraz w szpilkach drzew iglastych).
OH
O
OH
OH
Mentol
Karwon
Pinen
Cytronelol
Geraniol
Rysunek 8
Diterpeny (C20)
Razem z olejkami eterycznymi występują często diterpeny (C20). Nazywa się je
żywicami lub balsamami. Do ważniejszych zalicza się kalafonię uzyskiwaną przy
destylacji drewna sosnowego, a także fitol – 20-węglowy alkohol połączony
wiązaniem estrowym z cyklicznym układem porfirynowym tworzący cząsteczki
chlorofili (Rysunek 9). Hydrofobowy ogon fitylowy pozwala na zakotwiczenie się
cząsteczki chlorofilu w błonie tylakoidu chloroplastów. Chlorofil zawiera cztery
połączone ze sobą pierścienie pirolowe, które łączy centralnie ułożony atom
magnezu.
W układzie porfirynowym występują naprzemienne wiązania pojedyncze
N
H
OH
O
R
O
P
O
O
O
NMe
3
9
sfingomielina
-
+
45
Ćwiczenie 2
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ
i podwójne, które tworzą układ rezonansowy. Istnieje kilka rodzajów chlorofilu:
chlorofil a, b, c, d i e. W roślinach naczyniowych występują dwie odmiany chlorofilu -
chlorofil a i chlorofil b. Wszystkie fotosyntezujące organizmy posiadają chlorofil a,
który absorbuje światło czerwone o długości fali około 680 nm i światło fioletowe o
długości fali 440 nm. Chlorofil b najintensywniej absorbuje światło
pomarańczowoczerwone i światło niebieskie. Różnica w budowie obu odmian
przejawia się, między innymi, zróżnicowaniem ich polarności (grupa formylowa
nadaje większą polarność cząsteczce chlorofilu b). Feofityna natomiast ma barwę
brunatno-oliwkową. Jest to cząsteczka chlorofilu a pozbawiona kationu magnezu (w
jego miejscu znajdują się związane z atomami azotu dwa atomy wodoru).
N
N
N
N
R
O
O
OMe
O
O
Mg
fitol
R = Me (chlorofil a), CHO (chlorofil b)
Rysunek 9.
Intensywny zielony kolor chlorofilu powoduje, że wykorzystywany jest on jako
pigment w przemyśle np.: chlorofil a używany jest do barwienia mydła, oliwy,
wosków, tkanin i kosmetyków. Komercyjnie dostępne pigmenty o strukturze
chemicznej podobnej do chlorofilu wytwarzane są w szerokiej gamie barw
np.: poprzez zastąpienie atomu magnezu atomem miedzi uzyskuje się pigment
o barwie jasnoniebieskiej.
Triterpeny (C30)
Istotną klasę lipidów zaliczanych do triterpenów stanowią steroidy będące
pochodnymi
steranu
–
czteropierścieniowego
układu
cyklopentanoperhydrofenantrenu. Najbardziej znanym związkiem tej klasy lipidów
jest cholesterol (Rysunek 10). Wchodzi on w skład błon komórkowych (stanowi około
50% lipidów błon komórkowych erytrocytów ssaków) i osłonek mielinowych
nerwów. Związek ten jest prekursorem m.in. hormonów sterydowych (hormonów
płciowych i kory nadnerczy) oraz kwasów żółciowych.
46
Ćwiczenie 2
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ
O
H
H
H
H
Rysunek 10.
Tetraterpeny (C40)
Do tetraterpenów zalicza się karotenoidy: żółtopomarańczowe karoteny
(np. -karoten, Rysunek 11) zbudowane z długich węglowodorowych łańcuchów oraz
ich pochodne – złocistożółte ksantofile.
Rysunek 11.
Oba rodzaje barwników występują najczęściej z chlorofilem pełniąc pomocniczą rolę
w fotosyntezie (absorbują światło o innej długości fali niż chlorofil) oraz działają
ochronnie, jako antyutleniacze. Mogą występować również w organach
i tkankach nie mających chloroplastów, np.: w płatkach kwiatów. Karoteny
i ksantofile są pojęciami zbiorowymi. W roślinach wyższych występują
np.: karoteny oraz różne ksantofile. Jednym z ksantofili jest luteina, zawierająca dwie
grupy OH podstawione w pierścieniach w pozycji para do długiego łańcucha
węglowodorowego.
B. Fotosynteza
Chlorofil obecny w roślinach wyższych, glonach, cyjanobakteriach, w procesie
fotosyntezy, bierze udział w zamianie energii świetlnej w energię chemiczną, gdzie z
dwutlenku węgla i wody powstaje glukoza i tlen uwalniany do atmosfery:
6CO
2
+ 6H
2
O → C
6
H
12
O
6
+ 6O
2
47
Ćwiczenie 2
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ
2.2. Wykonanie ćwiczenia
A. Czynności wstępne
Student 1 – ekstrakt z natki pietruszki
Porcję natki pietruszki (listki z 1 ‘pęczka’) (i innych zielonych części roślin - opcjonalnie)
bardzo drobno pokroić (przyniesione na pracownie przez studentów), przenieść do
moździerza i utrzeć dokładnie wraz z bezwodnym Na
2
SO
4
. Otrzymaną masę zalać 50 ml
etanolu, ponownie utrzeć w moździerzu i pozostawić na 5 minut. Przesączyć przez lejek
Buchnera pod zmniejszonym ciśnieniem (przemyć kilkoma porcjami etanolu: razem ok.
50 ml) i zatężyć na wyparce. Pozostałość rozpuścić w dichlorometanie i osuszyć nad
bezwodnym Na
2
SO
4
, odsączyć środek suszący. W przypadku lekkiego zabarwienia
przesącz zatężyć na wyparce.
Student 2 – ekstrakt z marchewki
Drobno startą marchew (jedna duża, umyta marchewka, przyniesiona przez studentów
na pracownie) zadać 100 ml mieszaniny heksan:aceton 1:1 (v/v) w kolbie stożkowej
(Erlenmayera), intensywnie zamieszać bagietką i odsączyć pod zmniejszonym
ciśnieniem na lejku Buchnera. Pozostałość na lejku przemyć dwukrotnie porcjami
rozpuszczalnika po 30 ml. Uzyskane przesącze połączyć, oddzielić warstwę heksanową
w rozdzielaczu. Warstwę wodną przemyć heksanem. Połączone warstwy organiczne
zatężyć na wyparce. Pozostałość rozpuścić w dichlorometanie i osuszyć nad bezwodnym
Na
2
SO
4
, odsączyć środek suszący, a przesącz ponownie zatężyć na wyparce.
Student 3 – przygotowanie kolumny chromatograficznej
W zlewce przygotować zawiesinę silica gelu (12-15g) w heksanie lub eterze naftowym.
Kolumnę przymocować pionowo do statywu za pomocą łapy. Przy pomocy bagietki
umieścić na dnie kolumny tamponik z waty. Zakręcić kranik w kolumnie i wlać do niej
przygotowaną zawiesinę żelu – usunąć pęcherzyki powietrza!!! Gdy żel ‘osiądzie’
umieścić na wierzchu jego warstwy krążek z bibuły. U wylotu kolumny umieścić
odbieralnik o odkręcić kranik kolumny. Gdy poziom rozpuszczalnika zrówna się z
poziomem żelu zakręcić kranik.
B. Wykonanie chromatografii
Student 1 i Student 2 - Wykonanie chromatografii cienkowarstwowej (TLC) barwników
roślinnych
Na płytce chromatograficznej (5-6 cm x 5 cm) narysować delikatnie ołówkiem 2 linie ok.
0,5 cm od brzegów. Na jednej linii zaznaczyć 6 punktów oznaczonych: P – ekstrakt
z pietruszki, I – ekstrakt z dowolnie wybranych liści (opcjonalnie), M – ekstrakt
z marchwi. Nanieść w odpowiednie miejsca na zaznaczonej linii za pomocą kapilar
otrzymane ekstrakty. Czynność tę należy powtarzać kilkakrotnie aż do uzyskania
intensywnego zabarwienia plamek. Tak przygotowaną płytkę umieścić plamkami do
48
Ćwiczenie 2
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ
dołu w komorze chromatograficznej z układem rozpuszczalników heksan:aceton 8:2
(v/v) i rozwijać aż do momentu gdy czoło rozpuszczalnika osiągnie narysowaną górną
linię. W celu identyfikacji plamek porównać ich położenie z plamkami wzorców oraz
wykorzystać informacje zawarte w tabelce.
Barwnik
barwa
R
f (heksan:aceton 8:2)
1
karoten
pomarańczowy
0.95
2
feofityna
oliwkowozielony
0.50
3
chlorofil a
niebiesko-zielony
0.32
4
chlorofil b
żółto-zielony
0.25
5
ksantofile
żółty
0.16-0.08
Student 3 - Wykonanie chromatografii kolumnowej (oczyszczanie β-karotenu)
Ekstrakt z marchewki rozpuścić w niewielkiej ilości mieszaniny eter naftowy: chlorek
metylenu (9:1) i nanieść przy pomocy pipety Pasteura na kolumnę, tak by nie naruszyć
struktury żelu. Pozostałość w kolbce zostawić do testów TLC. Odkręcić kranik kolumny.
Gdy czoło rozpuszczalnika osiągnie poziom żelu delikatnie pipetką Pasteura spłukać
resztki substancji stosowanym eluentem. Ponownie odkręcić kranik i poczekać aż
rozpuszczalnik ‘wsiąknie’, zakręcić kranik i na wierzchu warstwy silica gelu umieścić
tamponik z waty. Następnie wlać delikatnie za pomocą pipety kilka ml rozpuszczalnika,
po czym wlać około 50 ml eluentu i odkręcić kranik. Eluat zbierać do odbieralników. Dla
frakcji o intensywnym pomarańczowym zabarwieniu wykonać test kontrolny TLC
wobec surowego ekstraktu z marchwi stosując jako eluent układ eter naftowy: chlorek
metylenu (9:1). Frakcje zawierające β-karoten połączyć i zatężyć na wyparce i zważyć.
2.3. Przygotowanie sprawozdania
Wykonanie rysunków schematycznych obrazujących wykonane doświadczenia (lub
krótki opis słowny).
Umieścić w sprawozdaniu schematyczny rysunek chromatografu (uwzględniając
barwy każdej plamki). Do sprawozdania dołączyć wykonane płytki.
Wyznaczyć wartości R
f
dla poszczególnych plamek, porównać je z wartościami
wzorcowymi i określić charakter związków zawartych w poszczególnych pasmach.
Na podstawie testu TLC określić czystość i skład frakcji głównej otrzymanej
w wyniku chromatografii kolumnowej.