40

Ćwiczenie 2

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ

IZOLOWANIE I

IDENTYFIKOWANIE

WYBRANYCH

BARWNIKÓW

ROŚLINNYCH

ĆWICZENIE 2

41

Ćwiczenie 2

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ

2. IZOLOWANIE I IDENTYFIKOWANIE WYBRANYCH ZWĄZKÓW

POCHODZENIA NATURALNEGO

2.1. Podstawy teoretyczne

A. Lipidy
Omawiane w tym ćwiczeniu barwniki należą do lipidów prenylowych. Lipidy to klasa
związków organicznych charakteryzująca się dużym zróżnicowaniem strukturalnym.
Wśród nich wyróżniamy:



Woski są estrami kwasów tłuszczowych i alkoholi monohydroksylowych o długich
łańcuchach węglowych (Rysunek 1).

O

O

12

27

Rysunek 1



Acyloglicerole to estry gliceryny i kwasów tłuszczowych. Triacyloglicerole zawierają 3
reszty kwasów tłuszczowych (Rysunek 2). Stanowią one najbardziej wydajny
zapasowy materiał energetyczny.

Rysunek 2

Naturalne kwasy tłuszczowe zbudowane są z długich, prostych łańcuchów
węglowodorowych, zawierających najczęściej od 10 do 20 atomów węgla
w cząsteczce. Zazwyczaj liczba atomów węgla jest parzysta.



Glicerofosfolipidy są zbudowane z glicerolu, którego dwie grupy OH tworzą estrowe
wiązania z kwasami tłuszczowymi, natomiast trzecia grupa OH jest zestryfikowana
kwasem ortofosforowym. Taką budowę ma najprostszy związek tej grupy – kwas
fosfatydowy (Rysunek 3). Pochodne kwasu fosfatydowego zawierają dołączone

O

O

R

O

R

O

O

R

O

1

2

3

Triacyloglicerol

42

Ćwiczenie 2

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ

estrowo

do

reszty

fosforanowej

alkohole

takie

jak

cholina

w lecytynie, czy seryna lub etanoloamina w kefalinach. Glicerofosfolipidy wchodzą w
skład wszystkich błon komórkowych. Spotyka się je także w znacznej ilości w
osłonkach mielinowych włókien nerwowych i otoczkach krwinek.

Rysunek 3



Gliceroglikolipidy Jest to grupa lipidów, które obok glicerolu i kwasów tłuszczowych
zawierają składnik cukrowy przyłączony do trzeciej grupy OH glicerolu (Rysunek 4).
Lipidy te są podstawowymi składnikami błon plastydów.

Rysunek 4

O

O

R

O

P

O

R

O

O

O

O

O

O

R

O

P

O

R

O

O

O

O

NH

3

O

O

O

O

R

O

P

O

R

O

O

O

O

NMe

3

1

2

anion fosfatydowy

1

2

fosfatydyloseryna

+

1

2

+

fosfatydylocholina (lecytyna)

43

Ćwiczenie 2

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ



Sfingolipidy Związki, w których reszta kwasu tłuszczowego połączona jest wiązaniem
amidowym z długołańcuchowym aminoalkoholem – sfingozyną (Rysunek 5). Związki
te noszą nazwę ceramidów.

Rysunek 5



Glikosfingolipidy zawierają oprócz kwasu tłuszczowego i sfingozyny resztę cukrową
(Rysunek 6). Należą tu cerebrozydy (z łac. cerebrum – mózg) i gangliozydy – lipidy
występujące w dużych ilościach w błonach komórek nerwowych mózgu.

Rysunek 6



Fosfosfingolipidy są to fosfolipidy, w których do sfingozyny, połączonej wiązaniem
amidowym z resztą kwasu tłuszczowego (ceramid), dołączona jest reszta kwasu
ortofosforowego dodatkowo zestryfikowana drobnocząsteczkowym związkiem
o charakterze alkoholu (seryna, etanoloamina, cholina) (Rysunek 7). Związki
zawierające cholinę nazywane są sfingomielinami, gdyż występują głównie
w osłonkach mielinowych nerwów.

N

H

OH

O

R

OH

9

ceramid (N-acylosfingozyna)

44

Ćwiczenie 2

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ

Rysunek 7



Lipidy prenylowe (zwane także izoprenoidowymi lub terpenoidowymi), których
szkielety powstają przez dołączanie pięciowęglowych reszt izoprenylowych
(2-metylobuta-1,3-dienowych).
Monoterpeny i seskwiterpeny (C10 i C15)
Do tej grupy związków zalicza się głównie olejki eteryczne (Rysunek 8). Spotykane się
je w kwiatach, liściach, owocach, nasionach, korze, a nawet drewnie niektórych roślin.
Są lotne, mają swoisty zapach. Należą do nich między innymi: mentol występujący w
liściach mięty, karwon (w nasionach kminku), cytronelol i geraniol (w kwiatach róży i
bodziszka), pinen (w drewnie oraz w szpilkach drzew iglastych).

OH

O

OH

OH

Mentol

Karwon

Pinen

Cytronelol

Geraniol

Rysunek 8

Diterpeny (C20)
Razem z olejkami eterycznymi występują często diterpeny (C20). Nazywa się je
żywicami lub balsamami. Do ważniejszych zalicza się kalafonię uzyskiwaną przy
destylacji drewna sosnowego, a także fitol – 20-węglowy alkohol połączony
wiązaniem estrowym z cyklicznym układem porfirynowym tworzący cząsteczki
chlorofili (Rysunek 9). Hydrofobowy ogon fitylowy pozwala na zakotwiczenie się
cząsteczki chlorofilu w błonie tylakoidu chloroplastów. Chlorofil zawiera cztery
połączone ze sobą pierścienie pirolowe, które łączy centralnie ułożony atom
magnezu.
W układzie porfirynowym występują naprzemienne wiązania pojedyncze

N

H

OH

O

R

O

P

O

O

O

NMe

3

9

sfingomielina

-

+

45

Ćwiczenie 2

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ

i podwójne, które tworzą układ rezonansowy. Istnieje kilka rodzajów chlorofilu:
chlorofil a, b, c, d i e. W roślinach naczyniowych występują dwie odmiany chlorofilu -
chlorofil a i chlorofil b. Wszystkie fotosyntezujące organizmy posiadają chlorofil a,
który absorbuje światło czerwone o długości fali około 680 nm i światło fioletowe o
długości fali 440 nm. Chlorofil b najintensywniej absorbuje światło
pomarańczowoczerwone i światło niebieskie. Różnica w budowie obu odmian
przejawia się, między innymi, zróżnicowaniem ich polarności (grupa formylowa
nadaje większą polarność cząsteczce chlorofilu b). Feofityna natomiast ma barwę
brunatno-oliwkową. Jest to cząsteczka chlorofilu a pozbawiona kationu magnezu (w
jego miejscu znajdują się związane z atomami azotu dwa atomy wodoru).

N

N

N

N

R

O

O

OMe

O

O

Mg

fitol

R = Me (chlorofil a), CHO (chlorofil b)

Rysunek 9.

Intensywny zielony kolor chlorofilu powoduje, że wykorzystywany jest on jako
pigment w przemyśle np.: chlorofil a używany jest do barwienia mydła, oliwy,
wosków, tkanin i kosmetyków. Komercyjnie dostępne pigmenty o strukturze
chemicznej podobnej do chlorofilu wytwarzane są w szerokiej gamie barw
np.: poprzez zastąpienie atomu magnezu atomem miedzi uzyskuje się pigment
o barwie jasnoniebieskiej.

Triterpeny (C30)
Istotną klasę lipidów zaliczanych do triterpenów stanowią steroidy będące
pochodnymi

steranu

–

czteropierścieniowego

układu

cyklopentanoperhydrofenantrenu. Najbardziej znanym związkiem tej klasy lipidów
jest cholesterol (Rysunek 10). Wchodzi on w skład błon komórkowych (stanowi około
50% lipidów błon komórkowych erytrocytów ssaków) i osłonek mielinowych
nerwów. Związek ten jest prekursorem m.in. hormonów sterydowych (hormonów
płciowych i kory nadnerczy) oraz kwasów żółciowych.

46

Ćwiczenie 2

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ

O

H

H

H

H

Rysunek 10.

Tetraterpeny (C40)
Do tetraterpenów zalicza się karotenoidy: żółtopomarańczowe karoteny
(np. -karoten, Rysunek 11) zbudowane z długich węglowodorowych łańcuchów oraz
ich pochodne – złocistożółte ksantofile.

Rysunek 11.

Oba rodzaje barwników występują najczęściej z chlorofilem pełniąc pomocniczą rolę
w fotosyntezie (absorbują światło o innej długości fali niż chlorofil) oraz działają
ochronnie, jako antyutleniacze. Mogą występować również w organach
i tkankach nie mających chloroplastów, np.: w płatkach kwiatów. Karoteny
i ksantofile są pojęciami zbiorowymi. W roślinach wyższych występują
np.: karoteny oraz różne ksantofile. Jednym z ksantofili jest luteina, zawierająca dwie
grupy OH podstawione w pierścieniach w pozycji para do długiego łańcucha
węglowodorowego.

B. Fotosynteza

Chlorofil obecny w roślinach wyższych, glonach, cyjanobakteriach, w procesie
fotosyntezy, bierze udział w zamianie energii świetlnej w energię chemiczną, gdzie z
dwutlenku węgla i wody powstaje glukoza i tlen uwalniany do atmosfery:

6CO

2

+ 6H

2

O → C

6

H

12

O

6

+ 6O

2

47

Ćwiczenie 2

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ

2.2. Wykonanie ćwiczenia

A. Czynności wstępne

Student 1 – ekstrakt z natki pietruszki
Porcję natki pietruszki (listki z 1 ‘pęczka’) (i innych zielonych części roślin - opcjonalnie)
bardzo drobno pokroić (przyniesione na pracownie przez studentów), przenieść do
moździerza i utrzeć dokładnie wraz z bezwodnym Na

2

SO

4

. Otrzymaną masę zalać 50 ml

etanolu, ponownie utrzeć w moździerzu i pozostawić na 5 minut. Przesączyć przez lejek
Buchnera pod zmniejszonym ciśnieniem (przemyć kilkoma porcjami etanolu: razem ok.
50 ml) i zatężyć na wyparce. Pozostałość rozpuścić w dichlorometanie i osuszyć nad
bezwodnym Na

2

SO

4

, odsączyć środek suszący. W przypadku lekkiego zabarwienia

przesącz zatężyć na wyparce.

Student 2 – ekstrakt z marchewki
Drobno startą marchew (jedna duża, umyta marchewka, przyniesiona przez studentów
na pracownie) zadać 100 ml mieszaniny heksan:aceton 1:1 (v/v) w kolbie stożkowej
(Erlenmayera), intensywnie zamieszać bagietką i odsączyć pod zmniejszonym
ciśnieniem na lejku Buchnera. Pozostałość na lejku przemyć dwukrotnie porcjami
rozpuszczalnika po 30 ml. Uzyskane przesącze połączyć, oddzielić warstwę heksanową
w rozdzielaczu. Warstwę wodną przemyć heksanem. Połączone warstwy organiczne
zatężyć na wyparce. Pozostałość rozpuścić w dichlorometanie i osuszyć nad bezwodnym
Na

2

SO

4

, odsączyć środek suszący, a przesącz ponownie zatężyć na wyparce.

Student 3 – przygotowanie kolumny chromatograficznej
W zlewce przygotować zawiesinę silica gelu (12-15g) w heksanie lub eterze naftowym.
Kolumnę przymocować pionowo do statywu za pomocą łapy. Przy pomocy bagietki
umieścić na dnie kolumny tamponik z waty. Zakręcić kranik w kolumnie i wlać do niej
przygotowaną zawiesinę żelu – usunąć pęcherzyki powietrza!!! Gdy żel ‘osiądzie’
umieścić na wierzchu jego warstwy krążek z bibuły. U wylotu kolumny umieścić
odbieralnik o odkręcić kranik kolumny. Gdy poziom rozpuszczalnika zrówna się z
poziomem żelu zakręcić kranik.

B. Wykonanie chromatografii

Student 1 i Student 2 - Wykonanie chromatografii cienkowarstwowej (TLC) barwników

roślinnych

Na płytce chromatograficznej (5-6 cm x 5 cm) narysować delikatnie ołówkiem 2 linie ok.
0,5 cm od brzegów. Na jednej linii zaznaczyć 6 punktów oznaczonych: P – ekstrakt
z pietruszki, I – ekstrakt z dowolnie wybranych liści (opcjonalnie), M – ekstrakt
z marchwi. Nanieść w odpowiednie miejsca na zaznaczonej linii za pomocą kapilar
otrzymane ekstrakty. Czynność tę należy powtarzać kilkakrotnie aż do uzyskania
intensywnego zabarwienia plamek. Tak przygotowaną płytkę umieścić plamkami do

48

Ćwiczenie 2

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ

dołu w komorze chromatograficznej z układem rozpuszczalników heksan:aceton 8:2
(v/v) i rozwijać aż do momentu gdy czoło rozpuszczalnika osiągnie narysowaną górną
linię. W celu identyfikacji plamek porównać ich położenie z plamkami wzorców oraz
wykorzystać informacje zawarte w tabelce.

Barwnik

barwa

R

f (heksan:aceton 8:2)

1

karoten

pomarańczowy

0.95

2

feofityna

oliwkowozielony

0.50

3

chlorofil a

niebiesko-zielony

0.32

4

chlorofil b

żółto-zielony

0.25

5

ksantofile

żółty

0.16-0.08

Student 3 - Wykonanie chromatografii kolumnowej (oczyszczanie β-karotenu)
Ekstrakt z marchewki rozpuścić w niewielkiej ilości mieszaniny eter naftowy: chlorek
metylenu (9:1) i nanieść przy pomocy pipety Pasteura na kolumnę, tak by nie naruszyć
struktury żelu. Pozostałość w kolbce zostawić do testów TLC. Odkręcić kranik kolumny.
Gdy czoło rozpuszczalnika osiągnie poziom żelu delikatnie pipetką Pasteura spłukać
resztki substancji stosowanym eluentem. Ponownie odkręcić kranik i poczekać aż
rozpuszczalnik ‘wsiąknie’, zakręcić kranik i na wierzchu warstwy silica gelu umieścić
tamponik z waty. Następnie wlać delikatnie za pomocą pipety kilka ml rozpuszczalnika,
po czym wlać około 50 ml eluentu i odkręcić kranik. Eluat zbierać do odbieralników. Dla
frakcji o intensywnym pomarańczowym zabarwieniu wykonać test kontrolny TLC
wobec surowego ekstraktu z marchwi stosując jako eluent układ eter naftowy: chlorek
metylenu (9:1). Frakcje zawierające β-karoten połączyć i zatężyć na wyparce i zważyć.

2.3. Przygotowanie sprawozdania



Wykonanie rysunków schematycznych obrazujących wykonane doświadczenia (lub

krótki opis słowny).



Umieścić w sprawozdaniu schematyczny rysunek chromatografu (uwzględniając

barwy każdej plamki). Do sprawozdania dołączyć wykonane płytki.



Wyznaczyć wartości R

f

dla poszczególnych plamek, porównać je z wartościami

wzorcowymi i określić charakter związków zawartych w poszczególnych pasmach.



Na podstawie testu TLC określić czystość i skład frakcji głównej otrzymanej

w wyniku chromatografii kolumnowej.