1
Hybrydyzacja kwasów
nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
• Dwuniciowe cząsteczki kwasów
nukleinowych (DNA, RNA) ulegają
denaturacji pod wpływem czynników
takich jak wysoka temperatura, wysokie
pH (środowisko zasadowe), niektóre
substancje chemiczne (mocznik,
formamid, guanidyna) o działaniu
chaotropowym
Hybrydyzacja
kwasów
nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’
ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
2
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’
ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
20
o
C
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’
ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
95
o
C
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’
ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
20
o
C
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’
ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
20
o
C
5’
ACUCUAGUCUGAACAGUCUGAUCGAUG
3’
3
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’
ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
95
o
C
5’
ACUCUAGUCUGAACAGUCUGAUCGAUG
3’
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’
ACUCUAGUCUGAACAGUCUGAUCGAUG
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
20
o
C
5’
ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG
3’
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’
ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
ll lll ll lll ll ll lll ll lll ll lll ll ll lll ll lll ll lll ll lll ll ll lll lll ll ll lll
4
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’
ACTCTAGTC
G
G
C
AC
CTGA
TGATCGATG
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
ll lll ll lll ll ll lll ll lll lll ll lll
ll lll ll ll lll lll ll ll lll
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’
ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
ll lll ll lll ll ll lll ll lll ll lll ll ll lll ll lll ll lll ll lll ll ll lll lll ll ll lll
Tm = 2 x n
A-T
+4 x n
G-C
Tm = 78
o
C
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’
ACTCTAGTC
G
G
C
AC
CTGA
TGATCGATG
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
ll lll ll lll ll ll lll ll lll lll ll lll
ll lll ll ll lll lll ll ll lll
Tm = 2 x n
A-T
+4 x n
G-C
Tm = 62
o
C
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
• Tm - jest to tzw. odwracalny punkt
topnienia - temperatura przy której istnieje
równowaga dynamiczna pomiedzy hybrydami
rozpadającymi się w wyniku denaturacji i
tworzącymi się w wyniku renaturacji.
• Ze statycznego punktu widzenia w tej
temperaturze 50% hybryd ulega rozpadowi.
• Tm - zależy od wielu czynników: stężenia
jonów Na
+
, liczby par G-C, długości hybrydy,
stężenia formamidu, lub mocznika.
5
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
długość
% G-C
formamid
Na
+
czynnik
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’
ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
5’
ACUCUAGUCUGAACAGUCUGAUCGAUG
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
5’
ACUCUAGUCUGAACAGUCUGAUCGAUG
3’
3’
UGAGAUCAGACUUGUCAGACUAGCUAC
5’
Hybrydy DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA
Ich stabilność jest zróżnicowana: RNA-RNA>DNA-RNA>DNA-DNA
Sondy molekularne
5’
GUCUGAACAGUCUGA
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
5’
GUCUGAACAGUCUGA
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
5’
GUCUGAACAGUCUGA
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
Barwnik fluorescencyjny
Izotop promieniotwórczy
Enzym
Sondy molekularne
Cy7 (IR)
32
P
Cy3
33
P
Oksydaza
Texas Red
35
S
Fosfataza
Rodamina
3
H (tryt)
Peroksydaza
Fluoresceina
14
C
Enzymy
Barwniki
Izotopy
Znakowanie
6
Sondy molekularne
5’
GUCUGAACAGUCUGA
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
5’
GUCUGAACAGUCUGA
3’
3’
TGAGATCAGAC
GCTGA
AGACTAGCTAC
5’
5’
GUCUGAACAGUCUGA
3’
3’
TGAGAT
AGTC
CTTGTCA
TGAC
AGCTAC
5’
Tm = 44
o
C
Tm = 30
o
C
Tm = 20
o
C
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja Southerna lub Northerna
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja Southerna lub Northerna
PCR
Reakcja Łańcuchowa Polimerazy
7
PCR
PCR
5’
GUCUGAACA
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
PCR
5’
GUCUGAACA
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
PCR
5’
GUCUGAACA
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
8
PCR
5’
GUCUGAACA
GTCTGAT
3’
3’
TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC
5’
PCR
PCR
PCR
• Matryca (DNA)
• 2 startery
• Polimeraza DNA
• Deoksyrybonukleotydy
– dATP
– dCTP
– dGTP
– dTTP
• Dodatki (bufor, Mg
2+
)
9
PCR
o
C
czas
95
72
54
cykl 1
cykl 2
cykl 3
cykl 4
PCR
PCR
PCR
10
PCR
PCR
PCR
PCR
11
PCR
PCR
Klonowanie
Klonowanie
12
Klonowanie
Klonowanie
Klonowanie
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
BMiGO Wykład 5 Izolacja RNA, hybrydyzacja, RT PCR
W 5 Izolacja RNA, RT PCR, hybrydyzacja 1
W5 sII PCR i sekwencjonowanie cz 2
w4 orbitale molekularne hybrydyzacja
Chemia wyklad I i II (konfiguracja wiÄ…zania Pauling hybrydyzacja wiazania pi i sigma)
2 4 Uklady hybrydoweid 20088 Nieznany
hybrydowy wymiennik ciepła
25. Co to jest metoda PCR i do czego służy - Kopia, Studia, biologia
PCR, AM, rozne, genetyka, genetyka, GENETYKA, Genetyka ze strony
12 Elektroforeza agarozowa wyizolowanego DNA ?łkowitego oraz produktów PCR
AFR wskaźnik sondy lambda
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych, III rok, Genetyka kliniczna
techniki pcr, IV rok, genetyka
Na czym polegała hybrydalność polskiego oświecenia, oświecenie(3)
Rozpiska Mikrobiologia Przemyslowa 09, BIO, PCR - DGGE, In Situ, API, Lab 1
analiza sondy ulicznej
więcej podobnych podstron