Izolacja RNA,

hybrydyzacja, RT-

PCR

RNA

•Ryboza ma w RNA
grupę

hydroksylową

przy węglu 2’ przez co
cząsteczki

RNA

są

znacznie

bardziej

reaktywne
i mniej stabilne niż
cząsteczki DNA.
•Wszystkie

komórki

produkują

enzymy

degradujące RNA -
RNazy.
•RNazy są uwalniane
w trakcie lizy komórek
w związku z czym są
obecne na skórze i
przenoszone

przez

dotyk.

RNA

Typowa

komórka

ssacza

zawiera 10

-5

μg RNA, z tego

80 – 85% stanowi RNA
rybosomalny (28S, 18S, 5.8S
i 5S).
Większość pozostałej części
stanowią tzw. „małe RNA”
(tRNA, snRNA, RNAi).
Cząsteczki mRNA stanowią
od 1 do 5% populacji RNA.

RNA całkowity, obraz prawidłowy

RNA zdegradowany

Elektroforeza

1. Sterylizacja szkła i plastików przed przystąpieniem

do pracy

2. Przygotowywanie roztworów w czystym szkle

i natychmiastowa sterylizacja w autoklawie

3. Roztwory używane do elektroforezy RNA powinny

być traktowane inhibitorem RNaz, np. DEPC
(Diethylpyrocarbonate) lub przygotowane na wodzie
traktowanej DEPC

4. Naczynie do elektroforezy powinno być również

płukane wodą traktowaną DEPC, najlepiej wydzielić
osobny

aparat

do elektroforezy dla pracy z RNA

5. Roztwory RNA należy trzymać w lodzie w czasie

pracy
a przechowywać w postaci wytrąconej pod etanolem
w temperaturze -70

o

C

6. W trakcie pracy z RNA należy zawsze używać

rękawiczek gumowych

Środki ostrożności przy pracy z RNA:

RNazy są enzymami stabilnymi, występują na powierzchni

skóry

i wszędzie gdzie obumierają komórki, dlatego

są na wszystkim czego dotykał człowiek lub zwierzę,

a także w wydychanym powietrzu

Przygotowanie całkowitego RNA

Przygotowanie poliA RNA – chromatografia powinowactwa

Elektroforeza RNA –

normalizacja, standardy

Normalizacja:

•Te same ilości RNA

•Te same ilości powszechnie występujących

transkryptów (tzw. housekeeping genes)

•Te same ilości poliA

+

RNA

(mierzone

metodami hybrydyzacyjnymi)

•Porównanie z syntetycznym pseudo-mRNA

Standardy masy

•Glioksalowane DNA

•Markery RNA syntetyzowane za pomocą
transkrypcji in vitro

•Rybosomalne RNA

Analiza sekwencji RNA lub DNA –

detekcja sekwencji

nukleotydowych

Masa molekularna

- elektroforeza w żelach

Metoda hybrydyzacji ze znakowana sondą

- znakowanie radioaktywnymi izotopami
-

znakowanie

biotyną

i

wykrywanie

przeciwciałami przeciw biotynie

• Elektroforeza jest metodą rozdzielania

zarówno cząsteczek DNA jak i RNA

• Detekcja

sekwencji

nukleotydowych

we fragmentach rozdzielonych drogą

elektroforezy

odbywa

się

poprzez

hybrydyzację ze znakowaną sondą

Metody detekcji sekwencji

nukleotydowych, hybrydyzacja

Ekstrakcja DNA

Cięcie enzymami restrykcyjnymi

Elektroforeza DNA w żelu i
przeniesienie rozdzielonych
fragmentów na membranę
nitrocelulozową

Reakcja hybrydyzacji z
radioaktywną sondą

Metoda hybrydyzacji DNA (lub RNA):

denaturacja badanego DNA
denaturacja sondy
renaturacja DNA w obecności sondy i powstanie
cząsteczek hybrydowych

Elektroforeza w żelu

agarozowym

Bufor obciążający:
Błękit bromofenolowy
Cyjanian ksylenu
Glicerol

Bufory używane do elektroforezy:

TAE: Tris - octan-EDTA
TBE: Tris – boran-EDTA

Metodą hybrydyzacji można wykrywać

obecność określonych sekwencji
nukleotydowych w DNA i w RNA

• Elektroforeza DNA lub RNA w

żelu agarozowym.

• Przenoszenie na filtr nylonowy

lub nitrocelulozowy.

• Denaturacja cząsteczek.
• Renaturacja

w

obecności

dużego nadmiaru znakowanej
sondy

(krótkiego,

jednoniciowego fragmentu DNA
zawierającego interesującą nas
sekwencję nukleotydową).

Wynik elektroforezy
całkowitego RNA

1-Preparat
zdegradowa
ny

Denaturacja DNA zachodzi w podwyższonej
temperaturze lub w obecności wysokich stężeń
formamidu lub mocznika

Przenoszenie materiału z żelu na filtr może
odbywać

się

z

wykorzystaniem

sił

kapilarnych

(blotting)

lub

poprzez

przyłożenie

pola

elektrycznego

(elektroblotting)

Gąbka

Żel

Filtr nylonowy

Bibuła zwykła

Folia plastikowa

Bibuła Whatmann 3MM

Gruby papier lub bibuła Whatmann

Piec hybrydyzacyjny

Wyniki hybrydyzacji

mRNA

z sondą GADPH

(dehydrogenaza 3-

fosforanu aldehydu

glicerolowego)

W

wyniku

hybrydyzacji

otrzymujemy

radioaktywny albo znakowany biotyną
prążek

w

miejscu,

w którym na żelu była obecna interesująca
nas sekwencja nukleotydowa

Elektroforeza
preparatów RNA z
różnych tkanek

Regiony o zmiennnej liczbie powtarzających się

tandemowo sekwencji

(VNTR – variable number of tandem repeats)

Trzy typy alleli VNTR występujące w różnych
kombinacjach u 6 osobników

Polimorfizm powtarzających się sekwencji

1 2 3 4 5 6

Wynik hybrydyzacji

Osobnik

Anemia sierpowata

PCR rozpoczynający się od

wyizolowanych cząsteczek

RNA

Reverse Transcriptase Mediated

PCR

(RT-PCR)

Polega

na

połączeniu

reakcji

odwrotnej transkrypcji z reakcją
klasycznego PCR

Służy

wykrywaniu

rzadkich

transkryptów

Stosuje się go także w aplikacjach:

1. RACE 5’: klonowanie końców 5'

transkryptów

2. RACE 3’: klonowanie końców 3’

transkryptów

Reverse Transcriptase Mediated PCR

(RT-PCR)

RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) to

metoda wzbogacania cDNA w końcowe fragmenty

sekwencji mRNA

Wykrywanie wirusa HIV metodą RT-PCR

Ilościowy PCR (Q-PCR)

3.

Pomiar

ilości

produktu

powstającego

we

wczesnej

fazie logarytmicznego wzrostu
(Real-time PCR).

1. Pomiar końcowego produktu
PCR
przy

użyciu

standardów

zewnętrznych

lub

wewnętrznych.

2. Pomiar produktu w czasie
(materiał pobierany w trakcie
reakcji PCR).

Real-Time

PCR

Aparat do PCR

sprzężony jest ze

spektrofotometrem

i wyposażony

w oprogramowanie

konieczne do analizy

danych.

Najlepsze metody określania ilości powielanej sekwencji
opierają się na pomiarze przyrostu produktu PCR w czasie
rzeczywistym.
Istnieją dwa typy metod różniące się specyficznością sondy
fluorescencyjnej

Barwniki interkalujące do
DNA (bromek etydyny) lub
inne, których fluorescencja
wzrasta pod wpływem
związania do dwuniciowego
DNA.
Obecnie najczęściej
stosowanym barwnikiem jest
SYBR

®

Green I.

Zalety:

Sonda jednakowa dla każdej
sekwencji. Amplifikacja
sygnału.

Wady:

Wiązanie z niespecyficznymi
produktami PCR. Zależność
od długości produktu.

Specyficzne sondy
zawierające barwnik
fluorescencyjny oraz
wygaszacz, zasada
działania z reguły
związana ze
zjawiskiem FRET

Zalety:

Detekcja
specyficznego
produktu. Brak
zależności od długości
produktu.

Wady:

Konieczność syntezy
specyficznej sondy dla
każdego produktu.

Zasady fizyczne FRET

(fluorescence resonance energy

transfer)

Transfer energii zachodzi

pomiędzy dwoma dipolami

o nakładających się

widmach emisji/wzbudzenia

i odpowiednim ustawieniu

względem siebie.

Efektywność transferu energii jest odwrotnie

proporcjonalna do r

6

, dlatego FRET występuje

pomiędzy cząsteczkami oddalonymi o 1-10 nm

(10-100 Å)

R

0

reprezentuje odległość, przy której

występuje 50% efektywność

przenoszenia energii

Przykładowe związki stosowane w technikach wykorzystujących FRET

fluoresceina

Izotiocjanian

fluoresceiny

(FITC)

Izotiocjanian

Tetrametylorodaminy (TRITC)

DABCYL, kwas [4-
((4-
(dimetyloamino)feny
lo)azo)benzoesowy]

5(6)TAMRA:

5-(and-6)-Karboksy
tetrametylorhodami

na

Sonda zawiera na końcach
komplementarne sekwencje tworzące
szpilkę do włosów

Sondy do RT-PCR

Dwuczęściowa sonda
wiążąca się do sąsiadujących
sekwencji

Dwa różne sposoby powiązania sondy ze starterem

1.

Produkt

DNA,

zdenaturowany
na dwie pojedyncze nici.

2. Sonda DNA, nie ulegająca wydłużeniu
(zablokowane końce).
Sonda ma barwnik fluorescencyjny na
końcu 5’ (R) i wygaszacz (Q) na końcu 3’.
W czasie hybrydyzacji (annealing) sonda
wiąże się do matrycy DNA.
Temperatura renaturacji dla sondy jest o
5-10

0

C wyższa niż dla starterów.

Sondy 5’ nukleazowe – schemat działania

3. Przyłączanie starterów do DNA
zawierającego sondę jest możliwe
po obniżeniu temperatury

4. Polimeraza Taq syntetyzuje nowe fragmenty DNA

rozpoczynając

od starterów (A).

Natknąwszy się na sondę DNA polimeraza odcina

nukleotydy począwszy od końca 5’ (aktywność 5’3’

egzonukleazy) (B).

W trakcie degradacji wygaszacz jest oddzielany od barwnika

fluorescencyjnego co wyzwala emisje światła (C).

W miarę postępu

reakcji w mieszaninie

zwiększa się ilość

wolnego, świecącego

barwnika

fluorescencyjnego.

Cykl 1 –

Cykl 2 –

Cykl 10 –

Detekcja przyrostu produktu
PCR

poprzez

przyłączanie

barwnika

Sybr®

Green

I.

Intensywność

świecenia

wzrasta po związaniu do ds
DNA i jest proporcjonalna do
ilości produktu PCR.

Podstawowe terminy analizy ilościowej PCR:

•

Obszar wartości podstawowej

-ilośċ cykli podczas których nie

obserwuje się zmiany sygnału fluorescencji

•

Ustalony próg (threshold)

wyznacza się zwykle jako

dziesięciokrotną wartość odchylenia standardowego mierzonego w

obszarze wartości podstawowej (zwykle w 5-15 cyklu)

•

Parametr C

T

(threshold cycle)

jest zdefiniowany jako numer cyklu

w którym wartości fluorescencji przewyższają ustalony próg

Numer kolejny cyklu

fl

u

o

re

s

c

e

n

c

ja

Krzywa zależności C

T

od

ilości próby (skala
logarytmiczna)

Wyznaczanie krzywej

standardowej przez

zastosowanie kolejnych

rozcieńczeń wzorcowego

DNA

Obecność wewnętrznego standardu fluorescencji
(np. ROX), który pozwala wyeliminować fluktuacje
fluorescencji

niezwiązane

z

oddziaływaniem

sondy z DNA, zwiększa rozdzielczość metody

ROX

Ilościowy PCR można też

wykorzystać do badania

aneuploidalności, czy

duplikacji sekwencji DNA.

Przypominam o przygotowaniu na

kolokwia

• 27. III. BioAut 1
• 28. III. Ch 1, ISE 1

• 1. budowa komórek prokariotycznych

i eukariotycznych.
2. zadania z rozcieńczeń roztworów.

3. budowa DNA i zasad azotowych.
4. instrukcja do ćwiczeń – działanie
odczynników w izolacji DNA (wstęp
teoretyczny).

Odrabianie zajęć wymaga

powiadomienia stałego

opiekuna grupy, oraz (na

odrabianych ćwiczeniach) –

opiekuna grupy,

w której są odrabiane

ćwiczenia.