Biochemia: Ćw. – Metoda RT-PCR

1

M

ETODA

RT-PCR

Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych:

bromek etydyny

– T+

EDTA

– Xi

etanol, 96%

– F

kwas octowy, 96%

– C



-merkaptoetanol

– N, T

Tris

– Xi

U

WAGI WSTĘPNE

Praca z kwasami nukleinowymi (np. izolacja, reakcja PCR) wymaga zachowania szczególnej czystości, ponieważ kwasy nukleinowe łatwo ulegają degradacji. Dotyczy to głównie

RNA, ze względu na powszechną obecność rybonukleaz (RNaz) – enzymów katalizujących niespecyficzne rozrywanie łańcuchów rybonukleinowych. Poniżej zamieszczono kilka

uwag istotnych podczas eksperymentów, w których używamy kwasów nukleinowych.

Wszystkie czynności wykonujemy w czystych rękawiczkach, które przemywamy 70% etanolem.
Wszystkie końcówki, probówki i szkło muszą być autoklawowanie.
Izolację kwasów nukleinowych oraz przygotowanie reakcji PCR przeprowadzamy w komorze laminarnej wysterylizowanym lampą UV. Miejsce do izolacji i aparat do
rozdziału elektroforetycznego przemywamy 70% etanolem.
Bufory z zestawu do preparatyki kwasów nukleinowych, składniki zestawu do reakcji PCR, polimerazy pobieramy używając końcówek z filtrem.
PBS sterylizujemy przez filtrowanie (filtr o średnicy porów 0.2



m); bufory z gotowych zestawów do izolacji i reakcji PCR są sterylne.

Metoda łańcuchowej reakcji polimerazy poprzedzona odwrotną transkrypcją, RT-PCR (ang. reverse transcription polymerase chain reaction) służy m.in. do
analizy ekspresji badanego genu. Bezpośrednim i najbardziej miarodajnym sposobem sprawdzenia, czy gen ulega ekspresji w danej komórce jest wykrycie

obecności transkryptu danego genu – cząsteczek mRNA. Technika RT-PCR składa się z dwóch etapów:

- reakcji odwrotnej transkrypcji, w której mRNA przepisywane jest na cDNA,
- amplifikacji (wielokrotnego powielenia) cząsteczek cDNA metodą klasycznej reakcji PCR.

Ostatnim etapem badania ekspresji genu jest elektroforeza produktów (amplifikatów) reakcji PCR wykonywana najczęściej w żelu agarozowym.

1.

P

RZYGOTOWANIE

RNA

1.1

I

ZOLACJA

RNA

(

ZESTAW FIRMY

Q

IAGEN

)

Materiał do izolacji kwasów nukleinowych stanowią skrawki tkankowe, całe narządy pobierane od zwierząt, komórki ustalonych linii komórkowych lub linii

pierwotnych hodowane in vitro w naczyniach hodowlanych (szalkach Petriego, płytkach wielodołkowych lub butelkach). Zamieszczona poniżej procedura w

punktach 1 – 4 odnosi się do komórek adherentnych hodowanych in vitro.

1. Po osiągnięciu 70 – 90% zarośnięcia naczynia hodowlanego (szalki Petriego o średnicy 6 cm) komórki przemyć zimną pożywką nie
zawierającą surowicy a następnie zimnym sterylnym PBS*.

2. Po dokładnym odciągnięciu roztworu PBS komórki zebrać sterylnym skrobakiem do probówki typu Eppendorf o poj. 1.5 ml w 350



l

buforu lizującego RLT zawierającego



-merkaptoetanol. Tak zebrane komórki można przechowywać w temp. -70



C przez okres 1

miesiąca.

3. Do ekstraktów komórkowych dodać 350



l 70% etanolu, zamieszać pipetą.

4. 700



l mieszaniny nałożyć na minikolumnę do izolacji RNA. Po zwirowaniu (8000 RPM**, 15 s, RT***) kolumnę przełożyć do nowej

probówki wirowniczej o poj. 2 ml.

5. Dodać 700



l buforu RW1, zwirować (8000 RPM, 15 s, RT).

6. Kolumnę umieścić w nowej probówce wirowniczej o poj. 2 ml i dodać 500



l buforu RPE, zwirować (8000 RPM, 15 s, RT).

7. Kolumnę umieścić w nowej probówce wirowniczej o poj. 2 ml i dodać 500



l buforu RPE, zwirować (8000 RPM, 2 min, RT).

8. Kolumnę umieścić w nowej probówce wirowniczej o poj. 2 ml i zwirować w celu wysuszenia membrany (15000 RPM, 1 min, RT).

9. Kolumnę przenieść do probówki wirowniczej o poj. 1.5 ml i dodać na membranę 100



l wody wolnej od RNaz, zwirować (8000 RPM,

1 min, RT). Czynność powtórzyć nakładając na kolumnę eluat otrzymany z pierwszego wirowania.

*PBS (ang. Phosphate Buffered Saline) – zbuforowany roztwór soli fizjologicznej

**RPM (ang. Revolutions Per Minute) – liczba obrotów na minutę

***RT (ang. Room Temperature) – temperatura pokojowa

Biochemia: Ćw. – Metoda RT-PCR

2

1.2.

O

KREŚLENIE STĘŻENIA ORAZ CZYSTOŚCI

RNA

METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ

Kwasy nukleinowe selektywnie pochłaniają światło ultrafioletowe (UV) wykazując maksimum absorbancji przy długości fali 260 nm.

Zjawisko to znajduje zastosowanie w oznaczaniu stężenia kwasów nukleinowych, np. w preparatach kwasów nukleinowych po izolacji.

Ekstrakty kwasów nukleinowych mogą być zanieczyszczone np. białkami lub odczynnikami używanymi do izolacji. W celu określenia

czystości przygotowanego preparatu mierzy się OD również przy dł. fali 280 nm, stanowiącą maksimum absorbancji dla białek. Preparat

uznaje się za czysty wówczas, kiedy stosunek wartości absorbancji A

260

/A

280

dla RNA jest równy lub zbliżony do 2.0. W przypadku, gdy

stosunek wartości A

260

/A

280

jest niższy, roztwór RNA jest zanieczyszczony białkami.

Wykonanie: W spektrofotometrze do mikroobjętości (Thermo Scientific Nano-Drop 2000) zmierzyć absorbancję przy dł. fali

260 i 280 nm względem próby ślepej (wody wolnej of RNaz). Spektrofotometr dla warstwy absorbującej równej 10 mm

w oparciu o zadaną wartość współczynnika absorbancji (dla RNA 1 jednostka A

260

równa jest 40



g/ml) przelicza zmierzoną

wartość absorbancji na stężenie wyrażone w ng/µl. Wyliczona przez spektrofotometr wartość ilorazu A

260

/A

280

świadczy

o czystości preparatu.

1.3.

P

RECYPITACJA

RNA

W przypadku uzyskania preparatu RNA o bardzo małym stężeniu (często uniemożliwiającym pomiar metodą spektrofotometryczną)

roztwór możemy zagęścić przez precypitację (strącanie) z użyciem środków odwadniających. Najczęściej do precypitacji używa się

alkoholi: etanolu lub izopropanolu. Wydajność precypitacji kwasu nukleinowego zwiększa użycie schłodzonego alkoholu; samą

precypitację też wykonuje się w niskiej temperaturze (4



C lub -20



C).

Wykonanie: Przygotować probówkę typu eppendorf o poj. 0.5 ml. Do 100



l roztworu wyjściowego RNA dodać

10



l 3M CH

3

COONa, pH 5.2 (RT) oraz 250



l 96% etanolu (-20



C). Wymieszać dokładnie i inkubować przez

30 min w temp. -20



C. Wytrącone RNA wirować przez 10 min, 13000 RCF, RT (wirówka miniSpin plus, Eppendorf). Zebrać

dokładnie nadsącz a peletę przemyć 250



l 70% etanolu (RT) i zworteksować. Ponownie zwirować przez 10 min, 13000

RCF, RT (wirówka miniSpin plus, Eppendorf). Po dokładnym zebraniu nadsączu peletę wysuszyć pod lampką (ok.10 min)

a następnie rozpuścić w 10



l wody dejonizowanej.

W celu określenia odzysku RNA po precypitacji zmierzyć jego stężenie w roztworze wyjściowym oraz precypitacie (pkt. 1.2).

Określić ilość RNA w roztworze wyjściowym i precypitacie oraz procent RNA odzyskany po precypitacji. Wyniki zamieścić

w tabeli 1. Skomentować czystość roztworów RNA oraz wydajność precypitacji RNA.

Tab.1. Bilans precypitacji RNA.

roztwór RNA

A

260

A

280

A

260

/A

280

stężenie RNA

[ng/µl]

ilość RNA

w danej objętości [µg]

odzysk RNA

[%]

wyjściowy

precypitat

Biochemia: Ćw. – Metoda RT-PCR

3

2.

O

DWROTNA TRANSKRYPCJA

Cząsteczki kwasu mRNA przed amplifikacją w reakcji PCR należy przepisać na cDNA (ang. complementary DNA) w procesie odwrotnej

transkrypcji z użyciem enzymu – odwrotnej transkryptazy (RT, ang. reverse transcriptase).

Wykonanie: W probówce typu eppendorf o poj. 0.5 ml 1



g RNA rozcieńczyć wodą wolną od RNaz do obj. 5



l. W kolejnej probówce

o poj. 0.5 ml przygotować mieszaninę reakcyjną, składającą się z: buforu 10-krotnie stężonego, roztworu czterech

deoksyrybonukleozydotrifosforanów (dNTP), krótkich fragmentów oligodeoksyrybonukleotydowych (dT23), wody wolnej od RNaz oraz

enzymu – odwrotnej transkryptazy. Zamieszczona poniżej tabela 2 zawiera skład mieszaniny reakcyjnej na jedną próbkę.

Tab.2. Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji odwrotnej transkrypcji.

składniki mieszaniny

objętość [



l]

1.

bufor

10x stężony

2

2.

5 mM dNTP

2

3.

70



M oligo dT23

0,3

4.

woda wolna od RNaz

9,7

5.

odwrotna transkryptaza

1

.

objętość całkowita

15

Równocześnie z próbką badaną przygotować kontrolę negatywną: mieszanina reakcyjna z wodą wolną od RNaz w miejsce RNA.

Odwrotną transkryptazę dodać na końcu, tuż przed dodaniem mieszaniny do probówki zawierającej RNA. Po zwirowaniu, probówki

umieścić w bloku grzejnym i prowadzić reakcję zgodnie ze schematem podanym w tabeli 3.

Tab.3. Etapy odwrotnej transkrypcji.

nazwa cyklu

temperatura

czas [min]

1.

wstępna denaturacja

65ºC

5

2.

odwrotna transkrypcja

37ºC

60

3.

przerwanie reakcji

95ºC

5

4.

koniec reakcji

4ºC

Biochemia: Ćw. – Metoda RT-PCR

4

3.

A

MPLIFIKACJA C

DNA

METODĄ

PCR

Technika PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy lub reakcja łańcuchowa polimeryzacji) zapewnia uzyskanie w przeciągu krótkiego czasu

milionów – miliardów kopii badanego fragmentu DNA. Miejsce syntezy w cząsteczce cDNA wskazują startery – krótkie sekwencje

nukleotydowe komplementarne do początku i końca powielanego odcinka cDNA. Proces syntezy katalizowany jest przez termostabilny

enzym – polimerazę DNA (najczęściej stosowana jest polimeraza Taq wyizolowana z termofilnych bakterii Thermus aquaticus).

Wykonanie: Do probówki o poj. 0.2 ml dodać 2



l (300 ng) cDNA. Przygotować mieszaninę odczynników do reakcji PCR – jedną wspólną

dla wszystkich próbek dla danego genu. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodzi: bufor (10-krotnie stężony), Q-solution, roztwór czterech

deoksyrybonukleozydotrifosforanów (dNTP), MgCl

2

(jony magnezu są kofaktorami polimerazy Taq), para starterów (R – ang. reverse

i F – ang. forward), woda wolna od RNaz oraz polimeraza Taq. Zamieszczona poniżej tabela 4 zawiera skład mieszaniny na jedną próbkę.

Tab.4. Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji PCR

składniki mieszaniny

objętość [



l]

1.

bufor

10x stężony

2.5

2.

Q-solution

5

3.

10 mM dNTP

1.6

4.

MgCl

2

1

5.

20



M starterów R

1

6.

20



M starterów F

1

7.

woda wolna od RNaz

7.65

8.

polimeraza Taq

0.25

objętość całkowita

20

Równocześnie z próbką badaną przygotować kontrolę negatywną (mieszanina reakcyjna z wodą wolną od RNaz w miejsce cDNA).

Polimerazę Taq dodać na końcu, tuż przed przeniesieniem mieszaniny do probówki zawierającej matrycę. Po krótkim zwirowaniu probówki

umieścić w termocyklerze PCR i prowadzić reakcję zgodnie ze schematem podanym w tabeli 5.

Tab.5. Etapy reakcji PCR.

nazwa cyklu

temperatura

czas [min]

1.

wstępna denaturacja

94ºC

3

2.

denaturacja

94ºC

1

3.

hybrydyzacja

temp. zależy od starterów

1

4.

wydłużanie

72ºC

2

30 - 35 cykli (pkty: 2 – 4)

5.

końcowe wydłużanie

72ºC

10

6.

koniec reakcji

4ºC

Biochemia: Ćw. – Metoda RT-PCR

5

4.

E

LEKTROFOREZA AGAROZO

WA PRODUKTÓW REAKCJI

PCR

Produkt reakcji PCR identyfikujemy rozdzielając uzyskany materiał w żelu agarozowym metodą elektroforezy. W celu określenia wielkości

badanego genu równocześnie rozdzielmy w żelu standardy masowe – fragmenty DNA o znanej wielkości wyrażonej w ilości par zasad (pz,

ang. base pair, bp). Na podstawie położenia badanego genu w stosunku do standardów masowych określamy jego wielkość. Rozdzielone

elektroforetycznie produkty reakcji PCR wizualizujemy przy użyciu fluorochromu bromku etydyny (EtBr), który interkalując z dsDNA

(dwuniciowym kwasem deoksyrybonukleinowym, ang. double stranded deoxyribonucleic acid) wykazuje intensywną fluorescencję

w świetle UV.

Wykonanie

Przygotowanie 2% żelu agarozowego

Do kolby stożkowej o poj. 250 ml dodać 0.8 g agarozy oraz 40 ml buforu TAE (40mM Tris-kwas octowy, pH 8.3, 1mM EDTA). Dokładnie

rozpuszczać agarozę ogrzewając w mikrofalówce przez 3 – 5 min. Zamieszać zawartość kolby; jeśli agaroza nie uległa rozpuszczeniu

kolbę umieścić ponownie na kilka minut w mikrofalówce. Złożyć podstawę na żel z płytkami zamykającymi oraz grzebieniem do

formowania studzienek. Do roztworu agarozy schłodzonego pod wodą bieżącą do temp. 50 – 60ºC dodać 2.5 μl bromku etydyny (uwaga!

bromek etydyny ma działanie karcynogenne!). Dokładnie wymieszać a następnie wylać żel na podstawę i odczekać do zastygnięcia

(30 – 40 min, RT). Wyjąć płytki zamykające podstawę z żelem oraz grzebień. Umieścić żel w aparacie horyzontalnym (poziomym)

wypełnionym buforem TAE (ok. 300 ml).

Przygotowanie próbek

Do probówki typu eppendorf o poj. 0.5 ml lub na kawałkach parafilmu przygotować próbki do elektroforezy dodając:

5 μl cDNA (amplifikatu uzyskanego w reakcji PCR),

1 μl buforu do próbek, 6-krotnie stężonego (Loading Dye Solution, Fermentas).

Wymieszać i krótko zwirować.

Rozdział elektroforetyczny

Próbki nałożyć do studzienek (kieszonek) wykonanych w żelu grzebieniem. Podłączyć elektrody do zasilacza i prowadzić rozdział przez

30 min przy napięciu 100 V. Pod wpływem pola elektrycznego ujemnie naładowane kwasy nukleinowe przemieszczają się w żelu

agarozowym od katody do dodatnio naładowanej anody z prędkością zależną od ich wielkości.

Wizualizacja kwasów nukleinowych

Po zakończeniu elektroforezy żel przenieść na folię. Wynik rozdziału elektroforetycznego

analizować w transiluminatorze Uvitec w świetle

UV.

Zalecana literatura:

"Biochemia" J.M. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer, PWN; W-wa 2005.

"Biochemia Harpera" R.J. Murray, D.K. Granner, V.W. Rodwell, PZWL, W-wa 2008

„Biologia molekularna. Krótkie wykłady" PC Hames, AG McLennan, AD Bates, MRH White, PWN, W-wa 2007

„Biochemia. Krótkie wykłady" BD Hames, NM Hooper, PWN, W-wa 2005